新型羊毛硫细菌素雷可肽的生物合成及其作用机制研究

Lantibiotics are attractive antibacterial agents due to their potency against multidrug-resistance pathogens and their distinguished modes of action. Lexapeptide is a new antibacterial peptide identified by the proposer’s group. Lexapeptide shown more potent antibacterial activity, better thermal stability, and better acid-/alkali-resistance than the most widely utilized lantibiotic, nisin. Lexapeptide is a new type of lantibiotic featuring a head of parallel connected giant double rings composed of a large thioether-linked ring and a rare aminovinyl-methyl-cysteine (AviMeCys)-linked ring, and a long linear peptide tail. Lexapeptide is distinguished from the known A or B type of lantibiotics from the aspects of sequence, chemical modifications, and overall structure. A novel class of lanthionine synthetase, composed of three unknown proteins LxmKXY, was also indicated in the lexapeptide biosynthetic pathway. This project intends to (1) characterize the novel lanthionine synthetase for the biosynthesis of lexapeptide through heterologous expression and biochemical studies; (2) investigate the substrate tolerance of the lexapeptide biosynthetic machinery on mutations on the precursor peptide; (3) produce lexapeptide derivatives with single and multiple point mutations, fluorescence group, and biotinylation labeling; (4) reveal the mode of action of lexapeptide using methodologies of Chemical Biology, Microbial Physiology and Structural Biology; and (5) explore the structure-activity relationship of lexapeptide for its structure optimization. This project will lay the foundations for the application development of lexapeptide and mining for novel lantibiotics.

羊毛硫细菌素对多重耐药菌抗菌活性强，杀菌机制独特，是新的抗微生物制剂研发热点。雷可肽是本课题组发现的新抗菌肽，其抗菌活性、热稳定性和酸碱耐受性均优于广泛使用的羊毛硫细菌素nisin。雷可肽具有硫醚环和稀有氨乙烯甲基半胱氨酸环组成的并联大双环头部和一条长的线性肽链尾部，其序列、化学修饰和整体结构均不同于已知的A或B型羊毛硫细菌素。同时，雷可肽基因簇编码一套新型羊毛硫氨酸合成酶，由三个未知蛋白LxmKXY组成。本项目拟通过异源表达和体外生化研究，阐明雷可肽合成途径的关键步骤以及新型羊毛硫氨酸合成酶的催化机理；研究雷可肽合成途径的底物宽泛性，构建合成雷可肽的单点突变、多点突变、荧光探针和生物素标记衍生物；结合化学生物学、微生物生理和结构生物学研究方法阐明雷可肽的杀菌模式和机理；研究雷可肽的构效关系，理性优化雷可肽结构。本项目研究为雷可肽的生产应用以及新型羊毛硫细菌素的资源挖掘奠定基础。

羊毛硫抗生素是由G+菌产生的核糖体合成后修饰的多环肽类天然产物。以乳酸链球菌素为典型代表，羊毛硫抗生素对多重耐药G+菌有强杀菌活性，抗菌机制独特，不易产生耐药突变，与临床抗生素药物没有交叉耐药现象。目前羊毛硫抗生素的挖掘已成为新型抗耐药性微生物制剂研发的热点。本项目利用前期建立的LEXAS技术激活了链霉菌Sal35的一个沉默基因簇，获得一个新型羊毛硫抗菌肽雷可肽(lexapeptide)，其对分枝杆菌、芽孢杆菌和耐甲氧西林葡萄球菌等具有较强抗菌活性。雷可肽是一个高度修饰的羊毛硫肽，其38个氨基酸残基中有9个翻译后修饰残基，包括脱氢丙氨酸(Dha，两个)、脱氢丁氨酸(三个)、(N, N)-二甲基苯丙氨酸、D-丙氨酸、羊毛硫氨酸(Lan)和S-[(Z)-2-氨烯基]-(3S)-3-甲基-D-半胱氨酸(AviMeCys)。本项目阐明了雷可肽的生物合成途径。分子中的D-丙氨酸残基由LxmJ还原酶特异性催化前体肽Dha28还原而成，该反应依赖F420为氧化还原辅因子。三个独立蛋白LxmK、X、Y组成一类新型羊毛硫氨酸合成酶，称为V型羊毛硫氨酸合成酶。通过基因敲除和前体肽点突变研究揭示雷可肽生物合成途径具有底物宽泛性，并获得脱氢雷可肽、去甲基雷可肽以及94个氨基酸取代衍生物。其中，T15A和G27A对多种革兰阳性菌的抗菌活性成倍提高。雷可肽处理后的细菌发生内容物泄漏，细胞壁破损，并积累肽聚糖合成前体UDP-N-乙酰胞壁酸五肽，表明雷可肽抑制细菌细胞壁合成。一定浓度Mg2+明显抑制雷可肽和乳酸链球菌素的抗菌活性，其中雷可肽耐受[Mg2+]范围更广。雷可肽对pH变化和高温的稳定性也优于乳酸链球菌素，具有更广泛的应用场景。以上成果发表7篇SCI论文和3篇中文核心期刊论文。获得2项发明专利授权。本项目为生物信息学挖掘基因组中新的V型羊毛硫抗生素奠定基础，为新型抗菌药物的研发提供了新的候选分子。