链霉菌源四氢异喹啉生物碱的生物合成与抗癌新药合成生物学研究

ET-743 (Yondelis®) is a famous star molecule belonging to tetrahydroisoquinoline alkaloids and originally isolated from the extraction of Ecteinascidia turbinate; it has been approved in Europe since 2007 for treatment of advanced soft-tissue sarcoma as the first anticancer drugs originated from marine natural products. However, the officinal source of ET-743 currently still relies on a semi-synthetic process requiring more than twenty steps of transformation from safracin B, owing to low yield of the extraction from its natural source (1 mg ET-743 per 1 kg of tunicate). Herein, we proposed to establish a new way to economically produce ET-743 or its analogues by reconstructing the biosynthetic pathway in a recombinant microorganism using synthetic biological approaches. To achieve this goal, we firstly focus on the characterization of the biosynthetic mechanism of several analogs belonging to the same family of metabolites originated from Streptomyces: we will clone the biosynthetic gene cluster of Lemonomycin, the fourth member of this family, based on the three gene clusters (Saframycin, Naphthridinomycin, and Quinocarcin) that we have studied; then, we will elucidate their biosynthetic pathways by comparative analysis, in vivo genetic and in vitro biochemical methods. Next, we will pay attentions to construct the recombinant strain producing more advanced analogs to ET-743 by synthetic biological strategies; which will be further used as starter materials for semi-synthesis or chem-biological synthesis to yield the marine anticancer drug.

ET-743是四氢异喹啉生物碱家族中的明星分子，来源于海鞘Ecteinascidia turbinata相关的代谢产物，于2007年成为第一例来源于海洋天然产物的抗肿瘤新药（商品名Yondelis®）。但其稀缺的来源限制了其进一步发展和推广。本项目针对这一瓶颈问题，以来源于链霉菌的具有类似化学结构和良好生物活性的同家族系列微生物代谢产物为对象，在前期获得了3个成员(番红霉素、萘啶霉素和喹诺卡星)生物合成基因簇的基础上克隆第4个化合物(草地霉素)的基因簇，通过比较基因簇、遗传与生化相结合等策略阐明其生物合成的基本途径；在此基础上采用合成生物学的理念和方法，构建代谢途径重组微生物，并采用微生物发酵大量积累更接近目标药物的结构类似物；进而建立通过化学半合成或化学-生物相结合获得抗肿瘤药物的新途径。

本项目以番红霉素（SFM-A）和萘啶霉素（NDM）为代表的四氢异喹啉类生物碱为目标分子，采用体内遗传及体外生物化学相结合研究其生物合成中特殊的酶学机制；进而通过合成生物学的策略探索建立制备ET-743的新途径。发表标注基金资助SCI论文10篇（IF>5论文6篇，包括2篇PNAS，3篇ACIE和1篇JACS）；申请国家发明专利1项；培养博士4人。. 在SFM-A的生物合成研究中，成功解密了生物合成途径的最后一步，涉及了两个关键蛋白SfmE和SfmCy2，它们分别参与了SFM-A生物合成中后期独特的前药激活及胞外脱氨修饰过程。细胞体内生成了SFM-A的分子骨架化合物，然而其携带的脂肪酸长链保护细胞内的DNA不受到伤害；随后跨膜蛋白SfmE将中间产物中的长链保护基解离，同时小分子被泵出胞外，实现前药激活；最后由一个分泌氧化蛋白SfmCy2完成胞外脱氨反应。. 在NDM的生物合成研究中，发现了一个分泌型、FAD依赖的氧化还原酶NapU在胞外氧化无活性前体生成具有生物活性的NDM，随后还可以进一步氧化使其失活。该研究揭示了一种原核生物罕见的“胞内药效团失活-前药外泌与成熟-胞外药效团再生-宿主周边活性抗生素浓度调控”复杂而精巧的时空隔离自抗性机制，进一步暗示了链霉菌富含复杂多样的胞外生理与生化。. 此外，我们还首次阐明了双环霉素（BCM）的完整生物合成途径，并实现了其体外酶催化合成。BCM是唯一已知的来源于天然产物的转录终止因子Rho蛋白选择性抑制剂。作为一种具有桥环结构、脂肪链被高度氧化修饰的生物碱，BCM生物合成中包括了连续多步惰性C-H键活化，以及在C-H键活化基础上的一步脱氢-环氧化-桥环形成过程。在解析BCM生物合成途径的同时，还实现了其体外酶催化全合成，不仅有助于将来采用合成生物学策略，创造此类新型抗耐药菌药物前体，还能够为分子合成提供中链氧杂桥环构筑的新途径和C-H键活化的新方法。