红小豆中与菜豆普通花叶病毒抗性相关基因的分离鉴定

Bean common mosaic virus is a newly identified virus in azuki bean with great yield losses in China. Isolation and identification of resistance-associated genes to plant virus is very important in anti-viral breeding. In this research, M4 generation of EMS-induced Jingnong 6 azuki bean mutants will be screened for BCMV resistance by agroinfiltration of BCMV infectious clone. To search the genomic differences between high-level virus-resistant mutants and wildtype, comparative genomic hybridization is conducted and candidate genes corresponding to the mutant sites are identified. Candidate genes will be over-expressed by bean pod mottle viral vector,the level of which is quantified by qRT-PCR. The infulence of candidate genes on BCMV replication or movement will be investigated by BCMV challenge through tracing the GFP reporter gene. And the subcellular localization of candidate genes will be disclosed through bombardment to onion epidermal cells with localization vectors. The direct interaction between proteins encoded by candidate genes and BCMV encoded proteins will be also expored.

菜豆普通花叶病毒（Bean common mosaic virus, BCMV）是我国红小豆上新发现的一种病毒，严重影响红小豆的产量和品质。抗病相关基因的分离鉴定对红小豆抗病毒育种具有重要意义。本研究拟用BCMV侵染性克隆农杆菌浸润的方法在EMS诱导的京农6号红小豆突变体M4代中筛选高抗BCMV的突变体，利用基于芯片的比较基因组杂交技术明确高抗突变体基因组发生变化的位点，结合生物信息学技术确定变化位点对应的基因。通过菜豆荚斑驳病毒载体过表达候选基因，利用实时荧光定量RT-PCR技术明确候选基因的过表达水平，再用BCMV侵染性克隆二次接种，利用BCMV侵染性克隆的的GFP报告基因确定候选基因对BCMV移动或者复制的影响，同时构建候选基因的亚细胞定位载体,利用基因枪轰击洋葱表皮细胞观察其定位，并验证候选基因是否与病毒蛋白直接互作，初步解析抗病机理。

红小豆是我国重要的杂粮作物，但是近年来植物病害的发生流行严重威胁其安全生产。菜豆普通花叶病毒（Bean common mosaic virus， BCMV）是红小豆上新近发现的病毒。本研究拟对红小豆不同种质资源对BCMV的抗性进行评价，以筛选出抗病材料，并利用分子生物学方法寻找抗性相关基因。针对以上目的，本研究利用田间自然发生和人工接种的方法对来自于世界各地的400余份栽培品种和300余份野生红小豆材料进行BCMV抗性鉴定，发现小豆资源中大部分材料抗性等级表现为抗病，中抗和感病。筛选出2份高抗栽培品种和3份高抗野生材料，高感病毒材料栽培种和野生材料各一种。该项工作为研究小豆资源的抗病机制以及抗病育种和抗病基因定位克隆奠定基础。根据筛选到的高抗和高感材料，利用转录组测序技术进行差异表达基因筛选，以期获得抗病相关基因，该项研究工作正在进行。基因沉默是植物抵御病毒侵染的重要途径，与该过程密切相关的蛋白有AGO、DCL和RdRp。利用生物信息学技术对红小豆中相关基因进行挖掘。根据不同蛋白的保守功能域，利用hmmer进行预测，在红小豆基因组中找到AGO蛋白11个，DCL蛋白7个，RdRp蛋白8个，并与大豆中相关蛋白进行比较。各个蛋白对BCMV侵染的响应正在进行。为明确不同产区红小豆病毒病害的病原是否一致，采集广东、江苏、安徽、陕西、河北、北京、吉林等地区红小豆病毒病病样，利用小RNA高通量测序技术进行病原鉴定。结果发现BCMV和CMV在各产区普遍存在，并且复合侵染。在江苏省南京地区，首次发现豇豆轻斑驳病毒（Cowpea mild mottle virus，CPMMV）侵染红小豆。同时克隆BCMV和CPMMV的全基因组序列，并分析其基因组特性，该研究为小豆病毒病病原的流行和监测提供基础。