普通菜豆抗炭疽病基因的克隆与功能研究

Discovery of effective resistance gene for breeding resistant genotypes is considered to be the most biologically safe and cost-effective management strategy. In the previous study, the anthracnose resistance gene isolated from the Andean genotype Hong yundou, was fine-mapped into a 46 kb region at the end of chromosome 1, where contained four candidate genes belonging to a novel disease-resistance gene family which encoded CRINKLY4 related protein. In this present study, firstly, we conduct association analysis, virus induced gene silencing and overexpression to initiate the functional verification to identify anthracnose resistance gene in Hong Yundou; and then the quantitative Real-time PCR and southern blot are used to perform for expression pattern of resistance gene; At last, we further clarify the transcription factors that regulating gene expression by analyzing promoter functional elements and RNA sequence. This study is not only expected to provide a theoretical basis for highly resistant varieties breeding of common bean using the resistance gene, but will facilitate the better understanding of resistance gene in plant.

挖掘有效抗病基因以培育新品种，是目前防治普通菜豆炭疽病最经济、有效、安全的方法。我们前期研究将普通菜豆Hong Yundou 中的抗病位点精细定位在1号染色体末端约46 kb区段内，发现该区段内有4个编码CRINKLY4类蛋白激酶的候选基因，属于新类型抗病基因，具有重要的研究意义。本项目拟通过自然群体关联分析、病毒诱导的基因沉默（VIGS）和基因过表达等技术验证4个候选基因功能，从而确定Hong Yundou 中的抗炭疽病基因；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR)和Southern 印迹杂交（Southern Blot）等技术明确抗病基因表达模式；通过启动子功能元件分析和转录组测序（RNA-Seq）等生物学方法，进一步阐明参与抗病基因表达调控的上游转录因子。本研究结果为实现利用该抗病基因进行普通菜豆分子育种奠定基础，同时将有助于人们进一步加深对植物抗病基因类型的认识。

挖掘有效抗病基因以培育新品种，是目前防治普通菜豆炭疽病最经济、有效、安全的方法。我们前期研究将普通菜豆Hong Yundou 中的抗病位点精细定位在1号染色体末端约46 kb区段内，该区段内有4个编码CRINKLY4类蛋白激酶的候选基因，属于新类型抗病基因。本研究通过候选基因转录组序列分析和PCR扩增发现，Hong Yundou中的抗炭疽病候选基因ORF8和ORF9是一个基因，命名为ORF89；通过分析68个的高抗炭疽病品种和103个高感病品种3个候选基因的序列多态性，结果显示抗病材料ORF89启动子序列与Hong Yundou序列完全一致，感病材料ORF89启动子序列与Jingdou序列完全一致，说明ORF89启动子序列缺失可能与功能相关；病毒诱导的基因沉默（VIGS）结果显示，接种炭疽病菌后，携带普通菜豆炭疽病候选基因ORF9的BMPV载体侵染的植株新叶片出现炭疽病病斑，与对照相比，VIGS植株表达量降低，说明基因ORF9与普通菜豆炭疽病抗性相关。Real-time PCR分析结果表明，ORF89的表达量在抗病材料中高于感病材料为1.54倍，ORF89对炭疽菌81号生理小种的响应结果显示，候选基因ORF89表达受菜豆炭疽菌的诱导。在抗性材料中基因于接菌后的6小时表达量达最高峰，而在接菌后48h内抗病材料的表达量几乎都高于感病材料中表达量。据此初步认为，ORF89调控普通菜豆炭疽病抗性。利用Southern Blot 分析抗病亲本普通菜豆Hong Yundou、感病亲本Jingdou 中候选基因拷贝数。结果显示基因ORF89在抗病亲本和感病亲本中拷贝数相同。说明候选基因ORF89表达差异不是由于拷贝数差异引起；亚细胞定位分析表明，普通菜豆ORF89蛋白位于细胞质膜上；Hong Yundou和Jingdou中的ORF89启动子与GUS报告基因相融合表达分析发现，Hong Yundou中ORF89启动子能表达GUS基因， Jingdou中启动子不能够成功表达GUS基因，说明ORF89基因启动子差异与功能密切相关。基于病原菌诱导后抗病基因ORF89在Hong Yundou中的表达模式进行转录组测序分析。其中候选基因ORF89归属于第10类，表达模式相同的基因包括418个。结合共表达差异基因的分子功能，预测获得了14个与基因ORF89共表达的抗病相关转录因子。