截短侧耳类抗菌药物的新耐药机制解析及其传播机理研究

Pleuromutilin antibiotics have been exclusively used in veterinary medicine. In recent years, due to the renewed development and application of novel pleuromutilin derivatives for human use, the pleuromutilin resistance mechanism has already become one of the research hotspots. The applicant has collected multiple pleuromutilin-resistant MRSA isolates from animal origin. In some of these isolates, we identified a novel pleuromutilin resistance gene lsa(E) and investigated its genetic environment and transmission mechanism. However, most of the pleuromutilin-resistant MRSA isolates did not contain any reported gene and mutations associated with pleuromutilin resistance, which suggested the existence of new pleuromutilin-resistance mechanism. This program elucidates the novel pleuromutilin resistance mechanism by electrotransformation, plasmid curing, plasmid or whole genome sequcencing, bioinformatic analysis, knockout and expression of the potential pleuromutilin resistance gene. On the basis, the epidemic situation of the new resistance gene in MRSA isolates from animal origin will be screened; phylogenetic relationship of the positive strains will be analyzed by PFGE; the transmission mechanism of the new pleuromutilin resistance gene will be illustrated by plasmid transferability analysis, southern blotting and drawing and interpretation of the structure of genetic elements associated with the transmission of the pleuromutilin resistance gene. This study is important for preventing and controlling the spread of antibiotic resistance, for developing new pleuromutilin drugs and for the Public Health.

截短侧耳类抗菌药物是兽医专用药。近年来该类衍生物在人医上的开发应用使其耐药机制成为国际上的研究热点。 在前期工作中，申请人分离到多株动物源截短侧耳类耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），从中我们发现一种新型截短侧耳类耐药基因lsa（E）并深入研究了其基因环境和传播机制。然而，尚有多数耐药菌株不含已知耐药基因及相关突变，提示仍存在新的耐药机制。本项目通过电击转化、质粒消除实验、质粒或全基因组测序、生物信息技术分析、基因敲除以及新基因的克隆表达等方法来阐明新型的截短侧耳类耐药机制。在此基础上，筛查新耐药基因在我国动物源MRSA菌株中的流行现状，利用PFGE技术研究阳性菌株的亲缘关系，应用质粒可转移性分析、southern 杂交定位以及介导新耐药基因转移的遗传元件结构解析来探明其传播的分子机制。上述研究对于控制耐药菌的扩散传播、指导新截短侧耳类药物的开发以及公共卫生都具有重要意义。

截短侧耳类抗生素（泰妙菌素和沃尼妙林)是畜禽专用抗菌药，用于防治猪和家禽的各种细菌感染,长期广泛的使用已使细菌对该类药物产生了耐药性。近年来，新的截短侧耳类衍生物瑞他帕林被批准用于人医由金黄色葡萄球菌和酿脓葡萄球菌引起的皮肤感染。截短侧耳类衍生物在人医上的应用使得该类药物的耐药机制研究成为热点。我们以动物源葡萄球菌为研究对象，开展了截短侧耳类耐药机制及其传播机理的研究。我们在猪源不同的葡萄球菌中鉴定出两个新型的截短侧耳类耐药基因lsa（E）和vga（E）v，二者均属于ABC转运子蛋白家族。通过全基因组和质粒测序，我们对新基因lsa（E）和vga（E）v的侧翼区和介导其转移传播的遗传结构进行了解析。lsa（E）由大小为40kb的质粒pv7037携带，其定位于一个新型遗传元件上的耐药基因簇。两个插入序列IS1216 和IS257位于该耐药基因簇两端，可能涉及到这些耐药基因的聚集和传播。Vga（E）v与Vga(E)蛋白只有85.3%的氨基酸同源性，定位于一个5584bp的小型质粒pSA-7上，并且发现于不同的葡萄球菌中。对pSA-7 进行全序列测定发现该质粒与来源MRSA的apmA携带质粒以及来自于其他葡萄球菌的dfrk携带质粒具有相同结构特点。生物信息学分析显示同源重组可能在该变异基因的获取中起到重要作用。在全国范围内分离获取共计582株截短侧耳类耐药葡萄球菌，调查结果显示，我国动物源葡萄球菌中截短侧耳类耐药机制包括：lsa（E）（412/582,70.8%）、 vga（E）（78/582,13.4%）、vga(E)v(45/582,7.7%)、vga（A）（21/582,3.6%），此外尚有部分菌株不含已有耐药机制（26/582, 4.5%）。利用套式PCR技术发现，lsa（E）和vga（E）v基因的侧翼序列保持高度一致性，提示相同遗传结构介导二者在动物源葡萄球菌中的传播扩散。本研究鉴定出两个新型截短侧耳类耐药基因，基本搞清了我国动物源葡萄球菌对截短侧耳类抗菌药物的耐药机制和传播机理，为控制耐药菌/耐药基因传播扩散、指导新型截短侧耳类药物开发以及公共卫生提供了科学依据。