基于拉曼光谱的牛ICSI和IVF早期胚胎差异研究

Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a powerful technique in the ?eld of assisted reproduction (ART) and provides exciting opportunities for studying the basic mechanisms of fertilization and early embryo development. Nevertheless, its application in agriculture and conservation biology has been greatly hampered by the low success rate reported for this method in respect of economically important species. Specifically, the rates of blastocyst formation and live newborn are greatly reduced when zygotes are generated by ICSI. ICSI remains a low e?ciency technology in comparison with alternatives such as in vitro fertilization (IVF) and its application is less widespread. Our previous study imply the potential of LTRS technique as a rapid, effective and noninvasive tool in assessing the quality of buffalo sperm cells. This technology can offer a most effective and precision method to allow rapid noninvasive assessment of embryonic reproductive potential before transfer. In this study, we determine differences in metabonomics, translocation of active mitochondria and cell apoptosis of early embryos generated by ICSI versus the less manipulative IVF with Laser Tweezers Raman Spectroscopy (LTRS) and fluorescence-labeled technique, providing dynamic change regularity. LTRS is used to investigate bovine early embryo and its culture media components during ICSI or IVF in order to explore factors causing low e?ciency in ICSI early embryo development with analysis of mathematical model and tentative assignments of specific peak, it can be used to stimulate research to further refine ICSI techniques. The method by LTRS paves the way for developing an independent assay to assess embryo status during ICSI or IVF providing new insights into difference in structure and component at the single cell level.

在辅助生殖领域，卵母细胞胞质内显微受精技术是研究受精和早期胚胎发育机制的一种重要方法；然而，与IVF相比，由ICSI形成的受精卵经体外培养后囊胚率、出生率都明显降低，这种低效率严重限制其被更广泛地应用。本课题组的前期研究表明激光光镊拉曼光谱技术可作为一种快速、有效且无损伤地评估精子品质的有力工具；我们推测，此技术可能成为研究早期胚胎发育的一种更精确、有效的方法。据此，本研究拟采用激光光镊拉曼光谱技术结合荧光标记法对比分析牛IVF和ICSI早期胚胎代谢组学、线粒体分布和细胞凋亡的差异；利用激光光镊拉曼光谱仪分析不同发育阶段的牛早期胚胎及其培养液的结构和组份变化，通过数学模型分析和对特征拉曼光谱的归属分析，探索ICSI胚胎发育率低的原因，从而为提高ICSI的效率和成功率奠定理论和方法基础，也为单个细胞水平上研究其结构和组分差异提供一个全新的视角。

卵母细胞胞质内显微受精技术是研究受精和早期胚胎发育机制的一种重要方法；然而，与IVF相比，由ICSI形成的受精卵经体外培养后囊胚率、出生率都明显降低，这种低效率严重限制其被更广泛地应用。据此，本研究收集ICSI和IVF不同发育阶段的早期胚胎，采用荧光染料JC-1和Annexin V-EGFP/PI检测ICSI和IVF早期胚胎的活性线粒体分布和细胞凋亡的动态变化规律；利用激光光镊拉曼光谱仪检测分析了不同发育阶段的ICSI和IVF早期胚胎及胚胎代谢液的结构和组份的差异变化；结合上述的检测结果对ICSI培养体系在一定程度上进行了优化。结果显示：活性线粒体在牛IVF与ICSI早期胚胎发育过程中发生了明显的位移差异变化。随着ICSI与IVF早期胚胎的发育，其凋亡率的差异值逐渐明显升高，囊胚期凋亡率差异显著，而在2-细胞期ICSI与IVF凋亡率无明显差异。与IVF相比，牛ICSI的2-细胞胚胎代谢液拉曼光谱的特征峰数量和强度变化最少，16-细胞胚胎代谢液拉曼光谱开始出现很多新的特征峰变化，囊胚阶段的胚胎代谢液拉曼光谱又出现更多新的特征峰且特征峰强度变化很大，说明ICSI胚胎发育过程中其结构、组份都发生了差异性变化，在一定程度上揭示了ICSI胚胎发育质量差、发育潜能低的原因。牛IVF与ICSI各阶段早期胚胎差异谱图发现，2-细胞期的差异光谱无明显变化，8-细胞期的差异光谱开始出现很多新的特征峰变化且特征峰强度有所增加，32-细胞期的差异光谱的特征峰强度变化最大，整个过程IVF组脂类的特征峰强度呈现递增的趋势，相反ICSI组的脂类含量呈现递减的趋势，推测可能是脂质过氧化反应或机械损伤导致膜破损所致。基于IVF培养体系优化结果和上述研究结果，在显微操作液和ICSI组的体外培养液中添加抗氧化剂10-9 M 褪黑素可显著提高ICSI操作后胚胎发育的囊胚率，有助于优化ICSI的培养体系。本研究成功将激光光镊拉曼光谱技术应用于ICSI胚胎损伤研究中，为今后开展相关研究奠定了方法基础，同时，这些研究结果有利于今后有针对性地筛选差异蛋白，为探索ICSI胚胎损伤的分子机制奠定理论基础，也为提高牛ICSI胚胎发育率提供了保障。