板蓝根中落叶松脂素生物合成关键酶IiPLR1蛋白晶体结构解析、改造与功能评价

Lignans such as lariciresinol represent anti-viral ingredients of Isatidis Radix (the root of Isatis indigotica). Our previous study indicated IiPLR1 is a key rate-limiting enzyme involved in lariciresinol biosynthesis of Isatis indigotica. However, the lower substrate specificity of IiPLR1 (it catalyzes pinoresinol to form lariciresinol, and also catalyzes lariciresinol to secoilariciresinol) hampers the biosynthetic efficiency of antiviral component lariciresinol. This project intends to carry out structural biology-based crystal structure elucidation and reconstruction of IiPLR1 to regulate lariciresinol biosynthesis more precisely. First, the crystal structure of IiPLR1 was analyzed to elucidate the structural basis of its substrate specificity. Then, a novel IiPLR1 mutant, which catalyzes pinoresinol to lariciresinol with high efficiency but does not catalyze lariciresinol, was obtained through rational design and mutagenesis of key amino acids to change the substrate binding pocket conformation and subsequent enzymatic activity screening. Finally, this IiPLR1 mutant was applied for genetic improvement of Isatis indigotica as well as synthetic biology research thus to regulate and synthesize lariciresinol more precisely and efficiently. This study not only provides a novel strategy for the quality improvement of Isatis indigotica (Isatidis Radix), but also has potential industrial application value for the large-scale production of this kind of lignans by using bioreactors.

以落叶松脂素为代表的木脂素类成分是中药板蓝根（菘蓝的根）发挥抗病毒活性的重要物质基础。我们前期研究发现，IiPLR1是菘蓝落叶松脂素生物合成的关键酶，然而，由于其催化底物专属性较低（催化松脂醇生成落叶松脂素，并进一步催化落叶松脂素生成开环异落叶松脂素），限制了抗病毒活性成分落叶松脂素的合成效率。本项目拟运用结构生物学理论与技术对IiPLR1进行晶体结构解析与改造，以实现其对落叶松脂素的精准调控：首先蛋白晶体结构解析，阐明IiPLR1底物特异性的结构基础；然后针对关键氨基酸进行理性设计和突变，改变底物结合口袋构象，通过酶活筛选获得高效催化松脂醇生成落叶松脂素且对落叶松脂素无催化作用的新型IiPLR1蛋白；最后将其应用于菘蓝遗传改良及合成生物学研究中，实现落叶松脂素的精准调控与高效合成。该研究将为菘蓝（板蓝根）的品质提升提供全新策略，也为通过生物反应器大规模生产此类木脂素展现良好的工业化前景。

以落叶松脂素为代表的木脂素类成分是中药板蓝根（菘蓝的根）发挥抗病毒活性的重要物质基础。IiPLR1是菘蓝落叶松脂素生物合成的关键酶，然而由于其催化底物专属性较低（催化松脂醇生成落叶松脂素，并进一步催化落叶松脂素生成开环异落叶松脂素），限制了抗病毒活性成分落叶松脂素的合成效率。本项目以提升IiPLR1对底物松脂醇的专属性为目标，开展了以下研究：首先，对IiPLR1的蛋白三维晶体结构进行了精细解析，准确描绘了PLR催化反应的全过程，通过对底物特异性差异显著的IiPLR1、AtPrR1和AtPrR2，及其底物复合物的蛋白晶体进行结构分析和比较，推测并借助氨基酸定点突变证明了位于46位、98位和181位的三个氨基酸是影响底物松脂醇催化效率的关键氨基酸残基，阐明了PLR/PrR底物选择性（松脂醇和落叶松脂素）的结构基础；然后，以此为依据对IiPLR1蛋白结构进行理性设计和改造，重塑底物结合口袋构象，改变其底物特异性（增强对松脂醇催化的专属性，阻断落叶松脂素的后续还原反应），高效促进了落叶松脂素的定向合成，其中突变体IiPLR1_V46A催化松脂醇的专属性提高了218倍；最后，以构建的生产松脂醇的大肠杆菌为底盘细胞，将筛选获得能精准催化目标活性木脂素成分落叶松脂素合成的IiPLR1突变体进行转化获得改造的工程菌，经过20小时的工程菌发酵，突变体IiPLR1_V46A实现了大肠杆菌中落叶松脂素的精准高效生产，产量达到997.79 mg/L。相关研究以项目负责人为第一作者发表在Nature Communication，申请国家发明专利1项，得到国家科技部重点专题评述。该研究是蛋白质工程在修饰中药药效物质生物合成过程的有益尝试，研究结果为菘蓝（板蓝根）的品质提升、促进其高效和可持续利用奠定了坚实的基础，也为通过生物反应器大规模生产此类木脂素提供了科学支撑并发挥了示范作用。