四倍体菘蓝聚合蛋白酶与松脂醇还原酶的功能及特征研究

菘蓝Isatis indigotica Fort，根入药，习称板蓝根，为清热解毒类的代表中药。四倍体菘蓝是我课题组培育的高产优良品系，具有显著的抗病毒活性。前期研究显示落叶松脂素和落叶松脂素苷是其高抗病毒活性的重要物质基础，但它们在四倍体菘蓝中的含量仍然较低（47.14ug/g和84.67ug/g）。催化菘蓝中落叶松脂素合成途径中最后两个步骤的聚合蛋白酶DP与松脂醇还原酶PLR的活性对整个途径的调控起到关键的作用。本研究拟首次分离得到四倍体菘蓝聚合蛋白酶与松脂醇还原酶及编码基因，并通过纯化蛋白及转基因四倍体菘蓝毛状根进行功能研究。在此基础上，结合本实验室已获得的该代谢途径中其它基因的表达特征信息，全面考察阐明整个途径的代谢流特征，为改造菘蓝中落叶松脂素代谢提供可靠依据。

以落叶松脂素为代表的木脂素类成分是传统中药板蓝根（原植物为菘蓝）发挥抗病毒活性的重要物质基础。本项目对菘蓝落叶松脂素生物合成途径中最后两个步骤的聚合蛋白酶DIR与松脂醇还原酶PLR进行表达特征与功能研究。通过菘蓝转录组注释获得了DIR基因家族19个IiDIR基因，对它们进行了全面的生物信息学分析及表达特征研究。分离获得了菘蓝IiPLR1基因并进行了表达特征研究；IiPLR1融合蛋白表达能有效催化松脂醇生成落叶松脂素，并能进一步催化落叶松脂素生成开环异落叶松脂素，证明了IiPLR1的体外催化功能；RNAi抑制表达IiPLR1显著降低了菘蓝毛状根中落叶松脂素的含量，证明IiPLR1是调控落叶松脂素生物合成的关键调控基因；过量表达IiPLR1将菘蓝毛状根中落叶松脂素的含量提高到353.9 μg/g，是野生型对照的约6.3倍，为通过代谢工程策略提升菘蓝品质提供了可行策略。对甲基茉莉酸MeJA诱导条件下落叶松脂素合成途径的基因表达和化合物积累水平进行整合分析，成功构建了“基因-代谢物”相关性网络，筛选获得了包含18个转录因子及2个关键途径基因的hub基因，全面阐明了菘蓝落叶松脂素代谢流特征，为通过遗传改造提升菘蓝品质提供了可靠依据。