青蒿素生物合成途径关键酶—紫穗槐二烯合酶（ADS）的蛋白质复合体结构解析及酶活性改造

Artemisinin, a sesquiterpene lactone containing a peroxide bridge isolated from Artemisia annua L., is an effective drug for malaria treatment. The biosynthesis of artemisinin belongs to plant isoprenoid metabolic pathway. The sesquiterpene synthase amorpha-4,11-diene synthase (ADS) is a key enzyme in artemisinin biosynthesis pathway, which uses farnesyl diphosphate (FPP) as substrate to produce the key precursor amorpha-4,11-diene for artemisinin biosynthesis. Despite the importance of ADS in artemisinin biosynthesis, the molecular basis of its catalytic mechanism remains elusive. Our research aims to use the methods of structural biology, molecular biology and biochemistry to solve the crystal structures of ADS and ADS-substrate complexes, and to elucidate the detailed mechanism of substrate binding and reaction. Through the comparative analysis of the structures of ADS and BOS, residues responsible for different cyclization mechanisms will be identified, and plastic residues will be revealed and rationally engineered for improving the catalytic efficiency and changing the product specificity.

具有内过氧桥的倍半萜内酯青蒿素来源于中药植物青蒿，它是目前治疗疟疾的最有效药物之一。青蒿素的生物合成属于植物类异戊二烯代谢途径。紫穗槐二烯合酶 (amorpha-4,11-diene synthase, ADS) 是青蒿素生物合成途径中重要的倍半萜合酶，它催化底物法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)环化生成青蒿素的重要前体紫穗槐二烯 (amorpha-4,11-diene)。目前对于ADS的催化机理仍不清楚。本项目拟采用结构生物学、结合分子生物学及生物化学的方法，解析ADS及其与底物或底物类似物的蛋白质复合体结构，阐释ADS结合与催化底物反应的分子机理。并通过对比ADS及相近的倍半萜合酶BOS的结构，阐明倍半萜产物环化的不同机制，挖掘影响酶活性及产物特异性的关键可塑性氨基酸位点，利用蛋白质工程进行理性突变及筛选，以期达到提高酶活和改变产物特异性的目的。

本项目主要围绕萜类合酶ADS的结构与酶促反应分子机制开展研究。项目实施三年，除完成既定的研究任务和目标外，也开展并完成发表了其它多种萜类合酶及后修饰酶的研究工作，取得了多项科研成果。取得的研究成果包括：①对倍半萜合酶ADS进行了详细的蛋白表达纯化、蛋白状态测定、酶活性分析、蛋白结晶及晶体优化、底物类似物合成等实验研究，解析了倍半萜合酶ADS的结构，揭示了ADS与其它倍半萜合酶的构象变化，发现了多个重要可塑性氨基酸残基，可用于突变以提高酶催化活性；②揭示了二倍半萜合酶AtTPS18和二萜修饰酶SrUGT76G1的分子催化机制，两篇论文都发表于Plant Communications（2020）；此外，还在本项目的支持下完成了两种BAHD酰基转移酶的催化机制研究及倍半萜衍生物棉酚中新的芳香化酶SPG的重要功能位点分析，论文发表于Frontiers in Plant Science（2021）和Nature Chemical Biology（2020）