miR-320家族与RACK1的关系及其对乳腺癌侵袭转移的作用和机制

We have reported for the first time that RACK1 is a superior independent predictor for poor clinical outcome in breast carcinoma. Through analysis of miRNA-array and our recent preliminary experiments, we presume that miR-320 family may participate in regulation of RACK1 expression. However, many problems still remain unclear. The present project firstly is to definite RACK1 mRNA is direct target of miR-320 family using luciferase reporter assay. Then we investigate the regulation of miR-320 to RACK1 expression、associations of their expressions with invasion/ metastasis and patients prognosis of breat carcinoma, and involved mechanism(s) both in vitro and in vivo, using miR-320x precursor or antagomiR-320x transfection etc. Moreover, utilizing ChIP-PCR and promoter reporter ssatlstem analysis etc., we will determine the regulatory factor of miR-320 family and signaling pathway of miR-320-RACK1. Thus,this research would provide new predictive biomarker of tumor metastasis and patients prognosis and new ulility therapic strategy for breast carcinoma.

我们在国内外率先报道：RACK1是优于任何目前常用的评价乳腺癌预后参考指标的蛋白；通过miRNA芯片结合软件分析和预实验结果推断：miR-320家族参与RACK1表达的调节。但miR-320家族与RACK1之间的调节关系及其对乳腺癌侵袭转移的作用和机制、miR-320家族表达的调节等问题尚不清。本研究拟采用荧光素酶报告基因系统确定RACK1与miR-320家族直接作用的存在，使用miR-320前体和抑制剂转染等法，通过体内、外实验两方面研究，明确miR-320与RACK1的相互调节、表达及与乳腺癌侵袭转移和病人预后的关系；并揭示其参与乳腺癌侵袭和转移的分子机制；用ChIP-PCR和启动子报告基因等方法，确定调控miR-320家族成员的转录因子和阐释miR-320-RACK1涉及的相关分子通路。从而为临床预测乳腺癌转移和预后提供新的生物学指标及有效的治疗靶点。

乳腺癌是危害妇女健康的常见恶性肿瘤，2012年新增乳腺癌患者167万，发病率位居全球女性肿瘤的首位。肿瘤的侵袭和转移是影响其疗效，导致肿瘤病人死亡的主要因素。近年，microRNA（miRNA）在肿瘤发生发展中作用的研究成为热点。.本课题对全基因组miRNA芯片筛选出的人正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞之间差异表达明显的miR-320a进行了如下深入研究。①通过实时荧光定量PCR法在细胞系和19对新鲜乳腺冰冻组织样本检测了miR-320a水平，发现miR-320a在高侵袭力乳腺癌细胞中显著低表达，及在新鲜乳腺癌组织中的表达明显低于正常乳腺组织；同时，采用原位分子杂交技术检测了miR-320a在130例浸润性乳腺癌组织中的表达和分析了其与临床病理学指标的关系，结果显示miR-320a在浸润性乳腺癌中的表达水平和乳腺癌肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、远处转移和预后负相关。②采用脂质体介导法分别将Pre-miR-320a及Anti-miR-320a转染人乳腺癌细胞，采用CCK-8法和流式细胞技术检测miR-320a对人乳腺癌细胞增殖的作用，使用transwell实验检测miR-320a对乳腺癌细胞迁移和侵袭行为的影响。研究表明，转染Pre-miR-320a或Anti-miR-320a可上调或下调乳腺癌细胞的miR-320a表达水平，与对照组相比，上调或下调miR-320a的表达水平对乳腺癌细胞增殖无明显影响；但升高miR-320a表达可以明显抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。 ③为了探索miR-320a抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭作用的分子机制，我们对生物信息数据库预测获得的miR-320a可能靶基因完成了双荧光素酶报告基因实验验证，结果表明miR-320a通过与其靶基因MTDH和Rab14的直接作用在乳腺癌发挥抑制癌细胞侵袭/迁移和转移过程。并且，实验证实MTDH可部分逆转miR-320a介导的迁移和侵袭抑制作用，及Rab14蛋白表达与乳腺癌患者的预后正相关。.我们课题的完成全面揭示了miR-320a在乳腺癌侵袭和转移过程中的作用及其分子机制，为乳腺癌治疗提供了新的可能的生物学靶点。