C/EBP-α蛋白赖氨酸乙酰化调控及其促进激活的HSCs凋亡的作用和分子机制研究

The differentiation of hepatic stellate cells (HSCs) is similar to that of adipocytes, therefore, the CCATT/enhancer binding proteins (C/EBPs) which play an important role in the differentiation of adipocytes, also regulate alterations of HSCs. We originally confirmed by in vivo and in vitro researches that C/EBP-α gene could relieve liver fibrosis through the induction of activated-HSCs apoptosis, and this effect of C/EBP-α gene have little impact on hepatocytes. More importantly, our recent preliminary experiments showed for the first time that lysine-acetylation exists in C/EBP-α protein and this modification could promote the expression of C/EBP-α protein and activated-HSCs apoptosis. These findings suggest that the acetylation of C/EBP-α protein may regulate the apoptosis of activated-HSCs, and possibly play an important role in liver fibrosis. The acetylation of C/EBP-α protein may be a breakthrough point of reversion of liver fibrosis. But these hypotheses still need further confirmation. Therefore, in this project, we will identify the specific acetylation and site in C/EBP-α protein, and explore the mechanisms of HSCs apoptosis induced by acetylated C/EBP-α protein. The main methods include mass spectrometry, co-immunoprecipitation and site-directed gene mutagenesis. Furthermore, we will observe the effect of histone deacetylase inhibitors (HDACIs) to reverse/relieve liver fibrosis and recovery of liver function through the liver fibrosis through animal model. This research will provide the new ideas and strategy for prevention and treatment of liver fibrosis.

肝星状细胞（HSCs）分化类似于脂肪细胞，调控脂肪细胞分化的 C/EBPs参与HSCs的调控。我们原创性体内、外研究已证实，C/EBP-α基因能诱导激活的HSCs凋亡使肝纤维化减轻但对肝细胞影响甚微；更为重要的是我们近期实验首次发现，C/EBP-α蛋白存在赖氨酸乙酰化修饰及乙酰化调控能促进其蛋白的表达和激活的HSCs凋亡，故科学地推测：C/EBP-α蛋白介导其乙酰化调控促进HSCs凋亡在肝纤维化过程中发挥着重要的作用，其可能是抑制/逆转肝纤维化的突破口。我们预实验的初步结果和科学推测等一系列问题尚需要严谨地证实和深入研究，因此，我们拟在本课题通过质谱分析、免疫共沉淀、基因定点突变等方法证实C/EBP-α蛋白的乙酰化修饰和相关问题，及其对HSCs凋亡的促进作用和分子机制；通过肝纤维化动物模型观察HDACs抑制/逆转肝纤维化和肝功能恢复的效果，为肝纤维化病人的防治提供新的思路和理论实验基础。

肝纤维化是肝脏对各种慢性肝损伤的一种修复反应，最终会进展为肝硬化，目前尚无有效治疗方法。肝星状细胞(HSCs)在肝纤维化过程中发挥着关键性作用。近年来，越来越多的临床数据和实验结果表明肝纤维化可以逆转。活化的 HSCs转至静止状态和活化的肝星状细胞凋亡是肝纤维化逆转的关键因素。我们前期原创性研究已证实：CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBP-α)基因能抑制HSC活化和诱导活化的HSC凋亡。近年，蛋白质翻译后修饰成为研究的热点之一，但关于C/EBP-α蛋白乙酰化的问题尚无报道。.本课题对于C/EBP-α蛋白乙酰化修饰的问题及其对激活的HSC凋亡的作用和机制进行了如下深入研究。①在两个HSC细胞株（HSC-6和LX-2），采用免疫沉淀和用去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）处理的方法，确定了C/EBP-α蛋白存在乙酰化修饰。通过构建C/EBP-α肽段质粒和C/EBP-α突变体质粒等方法，确定K276是C/EBP-α蛋白的乙酰化位点。②使用HDACIs处理HSC，应用Western blot和Realtime PCR的方法，观察到C/EBP-α蛋白水平增加；同时使用HDACIs与CHX共同处理细胞，观察发现C/EBP-α乙酰化修饰通过增加其蛋白稳定性使其水平上升。然后用降解抑制剂的实验证实C/EBP-α通过泛素-蛋白酶体途径降解；并通过免疫沉淀的办法观察到C/EBP-α的乙酰化修饰能抑制其泛素化修饰，从而使C/EBP-α蛋白降解减少进而使其蛋白水平累积性增加。③用HDACIs处理HSCs后，应用TUNEL和Western blot等方法观察到HSCs凋亡数和活性Caspase3蛋白表达增高，且Caspase8活性增加明显。结果提示C/EBP-α乙酰化修饰具有促进HSCs凋亡的作用，及主要是Caspase8外源性通路。④通过大鼠原代培养的HSCs实验证实TSA能有效逆转激活的HSCs。⑤通过动物体内实验，证实TSA可改善CCl4-诱导的肝纤维化模型鼠的肝纤维化程度和肝功能。.我们课题的完成全面揭示了C/EBPα蛋白乙酰化修饰及其促进激活的HSCs凋亡的作用和分子机制，为肝纤维化的防治提供了新的可能的策略。