EV71病毒受体及受体相关蛋白的筛选及鉴定

EV71是手足口病的主要病原，研究病毒受体对明确其感染机制、药物靶点等具有重要意义。当前病毒受体研究多采用噬菌体表面展示技术、病毒铺覆蛋白印迹技术、层析法、酵母双杂交系统、单克隆抗体技术、抗独特型抗体、受体重建技术等。EV71受体除Sialylated glycans、SCAR B2及P-selectin glycoprotein ligand-1外还有不明受体存在，推测可能是多蛋白复合体，因此采用上述擅长寻找单分子病毒受体方法无法完成对复合型受体的筛选。本项目拟制备宿主细胞膜蛋白多克隆抗体，利用病毒与细胞表面受体的结合阻断病毒受体特异性抗体，然后用被阻断的抗体Western-Blot中结合受体蛋白的原理来筛选病毒受体，通过蛋白质谱鉴定受体蛋白。该方法利用病毒感染细胞的天然过程，避免了蛋白处理过程中对其高级结构的影响和蛋白复合物的解体，因此该全新的方法用于筛选EV71受体极有可能获得成功。

EV71是手足口病的主要病原，研究病毒受体对明确其感染机制、药物靶点等具有重要意义。当前病毒受体研究多采用噬菌体表面展示技术、病毒铺覆蛋白印迹技术、层析法、酵母双杂交系统、单克隆抗体技术、抗独特型抗体、受体重建技术等。EV71受体除Sialylated glycans、SCAR B2及P-selectin glycoprotein ligand-1外还有不明受体存在，推测可能是多蛋白复合体，因此采用上述擅长寻找单分子病毒受体方法无法完成对复合型受体的筛选。本项目拟制备宿主细胞膜蛋白多克隆抗体，利用病毒与细胞表面受体的结合阻断病毒受体特异性抗体，然后用被阻断的抗体Western-Blot中结合受体蛋白的原理来筛选病毒受体，通过蛋白质谱鉴定受体蛋白。该方法利用病毒感染细胞的天然过程，避免了蛋白处理过程中对其高级结构的影响和蛋白复合物的解体，但是在多克隆抗体回收标记过程中效价降低显著，因此未能严格按计划进行。胰蛋白酶处理后的MA104细胞失去了吸附病毒的能力，因此课题组通过双向电泳分析处理前及处理后膜蛋白的差异，并进行质谱鉴定。将胰蛋白酶处理后的消化液上液质联用仪检测分析最终发现了包括：叶酸受体（F7BP60）、受体复合物（H9FU63）、SH3结构域结合的谷氨酸丰富的样蛋白质（H9G0H1）、CD63（F6XET9）、锚蛋白重复结构域蛋白（F7H1K0）、铜离子结合蛋白（G7N0P7）、内体溶酶体运输相关蛋白（F7GUE8）、微囊蛋白（Q07DZ2）、细胞外参与粘附的蛋白（F6SSW9）、膜联蛋白（F7H0C7）在内的多个潜在受体蛋白，其中的G7N0P7、F6SSW9具有清道夫受体活性，将成为重点研究对象，而F7H0C7也被证明与EV71感染相关，因此本研究为揭示EV71在宿主细胞MA104上利用的受体奠定了基础。