罗氏沼虾双顺反子病毒受体筛选及初步鉴定

Macrobrechium rosenbergii nodavirus (MrDV) is a novel virus that can cause Macrobrechium rosenbergii larvals experience large mortalities in a very short period. Now prevention and control of this disease is the priority for the development of shrimp aquaculture. As the receptors of MrDV target cell mediate virus attachment and entry, blocking MrDV from binding to receptors can effectively suppress the virus infection. So receptors finding and identification are the key point to figure out the MrDV infection mechanism, which is also the theoretical foundation for MrDV disease control. Here, on the foundation of etiology study, whole genomme sequencing and establishment of several detection methods, we further proposed to use the techniques of VOPBA, Co-IP and GST-affinity chromatography combinded with the methods of mass spectrometry, antibody preparing and purifing, immunofluorescence and the expreiments of blocking the infection of MrDV in vivo and in vitro to screening and preliminary identify the receptors of MrDV.

双顺反子病毒是一类新发现的病原，可引起罗氏沼虾幼体在短时间内发生大面积的死亡，造成巨大的经济损失，目前缺乏有效的防控方法。病毒受体是介导病毒侵入并促进病毒感染宿主细胞的主要决定因素，阻断病毒与受体结合可有效抑制病毒感染的发生。因此，本课题组在已完成双顺反子病毒病原学，序列测定，检测技术研发等工作的基础上，拟采用VOPBA技术，Co-IP技术，亲和层析技术等病毒受体研究方法结合质谱分析，抗体制备，免疫荧光及体内体外病毒感染阻断实验等方法筛选及鉴定罗氏沼虾双顺反子病毒受体。本研究将为阐明该病毒入侵机制及规律奠定基础，为该爆发性疾病的防控及新型抗病毒药物的开发提供新的靶位，为分子选育标记建立及抗病品种筛选提供新的切入点。

罗氏沼虾双顺反子病毒是一类新发现的病原，其感染可引起罗氏沼虾幼体短时间内发生大面积死亡，造成巨大的经济损失，目前对于该病原的感染尚缺乏有效的防控方法。病毒受体是介导病毒侵入并促进病毒感染宿主的主要决定因素，因此研究病毒受体对于研究病毒感染及其与宿主间相互关系具有重大的意义。本研究通过采用差速离心法获得罗氏沼虾7日龄幼体细胞膜蛋白，蔗糖密度梯度离心法获得罗氏沼虾双顺反子病毒，在此基础上，采用VOPBA技术成功获得7条与病毒相互作用蛋白条带，LC-MSMS质谱分析结果结合ncbi和GO数据库检索和分析，共鉴定获得11个候选受体蛋白，我们对其中的beta-actin,Rab 1A, Rab 18, Hsp 70，arginine kinase 1等5个蛋白进行了原核表达，蛋白纯化和抗体制备，进一步进行Co-IP验证，结果表明，上述5个候选受体蛋白均能与罗氏沼虾双顺反子病毒相互作用，且能和病毒的主要结构蛋白VP3相互作用。在此基础上，我们使用重组蛋白阻断罗氏沼虾双顺反子病毒感染实验，结果表明双顺反子病毒感染24 h后，添加了Rab 18重组蛋白的幼体仍有15-20%左右存活率，未添加Rab 18重组蛋白的感染组幼体全部死亡，表明添加Rab 18重组蛋白对于阻断双顺反子病毒感染，降低致死率有一定的作用。但是添加beta-actin等其余几个蛋白未能明显降低致死率，对此我们需要进一步设计实验进行研究。