水泡性口炎病毒G蛋白受体的筛选及鉴定

水泡性口炎病毒(VSV)是引起人和多种哺乳动物水泡性口炎的重要病原，但其感染的分子机制尚不明确。囊膜糖蛋白（G蛋白）在病毒感染过程中发挥重要作用，G蛋白受体在病毒感染过程中的致病机制也已成为研究的热点。本项目在体外原代培养新生犊牛口腔黏膜上皮细胞的基础上，构建含有VSV-G蛋白基因片段的诱饵质粒，采用酵母双杂交技术筛选上皮细胞膜中与VSV-G相互作用的受体基因；将筛选出的受体基因进行克隆和表达，应用镍离子亲和层析柱纯化表达的受体蛋白，将该蛋白与VSV孵育后接种口腔黏膜上皮细胞，检测该蛋白在VSV感染过程中的功能；采用荧光定量RT-PCR方法检测受体在体外培养细胞中的表达情况。本课题不仅为研究G蛋白及其受体在水泡性口炎发病机制中的作用奠定基础，同时有助于揭示病毒的感染途径和复制过程等一系列科学问题，而且为该病的防治和抗病育种提供重要的靶基因。

水泡性口炎病毒（VSV）是引起人和多种哺乳动物水泡性口炎的重要病原，其感染细胞的分子机制目前还不明确。为研究VSV在细胞膜上的受体，本项目以实验室前期分离的牛源VSV为研究对象，开展了VSV易感的牛肾细胞（MDBK）受体的筛选和鉴定工作。首先成功构建了用于酵母双杂交的MDBK细胞cDNA文库，用于下一步受体的筛选。同时，构建了VSV-G蛋白诱饵表达载体，并对其自激活和毒性进行了检测，表明构建的诱饵质粒并无自激活和毒性作用，可以用于酵母双杂交。将文库菌液与诱饵菌液杂交混合培养，将杂交产物于固体培养基上进行多次培养，筛选出两种与VSV-G相互作用的蛋白：半乳糖凝集素1（LGALS1）和核糖体蛋白S20（RPS20）。经验证，筛选得到的两种猎物质粒均能与诱饵蛋白而非PGBKT7空载体发生相互作用。分别将LGALS1和RPS20的基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中，构建LGALS1的重组质粒pGEX-4T-L和RPS20的重组质粒pGEX-4T-R，诱导表达LGALS1和RPS20蛋白，并对其进行了纯化，western blot检测结果表明二者成功表达。His pull-down试验对筛选到的两种蛋白与VSV-G蛋白间的相互作用进行了验证，表明GST-R融合蛋白能够与VSV-G蛋白在体外发生特异性结合，但相互作用较弱，而GST-L融合蛋白与VSV-G蛋白在体外发生特异性结合的相互作用较强；间接免疫荧光证实LGALS1和VSV-G在BHK-21细胞中可发生相互作用；将pN1-LGALS1和pEF1α-VSV-G共转染至BHK-21细胞中，通过免疫共沉淀试验进一步验证了LGALS1和VSV-G在细胞中的相互作用。应用荧光定量RT-PCR方法对VSV感染MDBK细胞前后LGALS1和RPS20的表达情况进行检测结果表明，感染后LGALS1和RPS20的表达量均有显著提高，提示这两种蛋白可能在VSV感染细胞有重要的意义。将VSV与表达的LGALS1蛋白相互作用后再接种细胞，与对照组相比，感染细胞出现CPE明显减少的特点，表明该蛋白具有干扰VSV对细胞的感染作用。但RPS20蛋白对VSV感染细胞的阻断效果相对较弱。综合以上结果分析，LGALS1可能为VSV感染细胞的受体蛋白。本研究为深入开展VSV的感染、复制和一系列的分子致病机制研究奠定了基础。