睡莲类黄酮糖基转移酶基因克隆及功能验证

Water lily,an herb of genus Nymphaea, the family Nymphaeaceae,is a precious perennial aquatic flowering plant.Water lily divides into two ecological groupes,namely tropical water lily and hardy water lily.It has rich and brightly colors.Tropical water lily has white，pink，red，orange，yellow，blue，indigo and blue-violet,while hardy water lily is lack of blue and blue-violet.We had analyzed the constitution and content of flower pigment in petals from 35 tropical water lily cultivars and 119 hardy water lily cultivars in our previous study,and found that anthocyanins in blue water lilies' petals are 3'-position glycosylation , while other colors are 3-position glycosylation, which may cause hardy water lily does not contain blue or blue-violet cultivars. Based on this study, we will attempt to obtain the transcript profiling from different colors of water lily petals through next-generation sequencing technique,analyze gene sequences which associated with anthocyanin 3'-position glycoside synthesis,obtain full-length UF3'GT gene. Quantitative PCR will be used to study the expression pattern in temporal and spatial of UF3'GT,then in different colors of water lily.The function of UF3'GT will be characterized by prokaryotic and eukaryotic expression system. Finally, we will demonstrate the petal blue coloration mechanism by combining the results of photochemistry and molecular biology, which will lay the foundation for the breeding of hardy water lily cultivars with blue and provide a new direction for blue flowers' breeding in ornamental plants.

睡莲是睡莲科睡莲属多年生水生草本植物，包括热带睡莲和耐寒睡莲两个生态类型，花色丰富艳丽，但耐寒睡莲不具有热带睡莲所拥有的蓝色、蓝紫色品种。本课题组前期对35个热带睡莲和119个耐寒睡莲品种的花瓣进行了花色表型及类黄酮成分分析，发现蓝色睡莲花瓣的花青素苷是3'位发生糖苷化，而其他颜色的则是在3位，这可能是导致耐寒睡莲没有蓝色、蓝紫色品种的原因。因此，本研究拟在前期研究的基础上，拟利用高通量测序技术获得不同花色睡莲品种的转录谱，分析与花青素3'糖苷化相关的基因序列，获得全长UF3'GT基因；通过荧光定量PCR技术进行不同花色和不同时空的表达分析；通过原核、真核表达分析该基因的功能。结合植物化学和分子生物学研究结果，揭示睡莲蓝色花形成的化学和分子机理，为蓝色耐寒睡莲育种奠定基础，并为观赏植物蓝色花育种提供新方向。

睡莲（waterlily）是睡莲科（Nymphaeaceae）睡莲属（Nymphaea）多年生水生草本植物，包含5个亚属超过50个种和亚种。睡莲花色丰富、清香远溢、花期长，在水体应用中的景观优势十分突出。根据生态类型，睡莲可分为热带睡莲和耐寒睡莲，耐寒睡莲不具有蓝/蓝紫色系的种及品种。热带睡莲在国内大部分地区不能室外自然越冬，为节约劳动成本和经济成本，满足人们对新颖花色的追求，培育新颖花色的耐寒型睡莲势在必行。解析睡莲花瓣中类黄酮代谢途径将为睡莲花色育种奠定基础，也对其他观赏植物花色育种具有指导意义。. 本项目首先分析了4个蓝/蓝紫色系睡莲花瓣中的花青素苷成分，发现飞燕草素-3'-O-（2''-O-没食子酰-6''-O-乙酰半乳糖苷）和飞燕草素-3-O-（2''-O-没食子酰-6''-O-乙酰半乳糖苷）含量较高。进一步分析‘泰国王’睡莲6个不同发育阶段（S1-S6）的花瓣中的类黄酮成分，共鉴定了16个类黄酮化合物，包括4个花青素苷以及12个黄酮醇苷。本项目挑选‘泰国王’睡莲两个发育阶段花瓣进行转录组测序，de novo组装后共得到112,485条unigenes，其中有26,206条unigenes有功能注释，共发现1,581条差异表达基因，参与类黄酮合成、花青素合成、黄酮和黄酮醇生物合成的差异表达基因有33个，其中28个unigenes在S3阶段表达水平上调，5个unigenes下调。.本项目共克隆得到7个类黄酮糖基转移酶基因，分别命名为NnGT1-NnGT7，这7个NnGTs均具有典型的PSPG-box。原核表达诱导蛋白及体外酶活反应发现，NnGT6可以UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖为糖基供体，对飞燕草素苷元、矢车菊素苷元、山奈酚苷元、槲皮素苷元、杨梅酮苷元和异鼠李素苷元均具有催化活性，生成相应的3-糖苷。NnGT6在‘泰国王’睡莲中的表达具有组织特异性，与花瓣中的类黄酮含量积累模式一致。通过叶盘法将NnGT6在烟草中异源表达，过表达NnGT6后烟草花冠颜色变深，类黄酮含量增加，表明NnGT6可以外源催化植物体内类黄酮化合物的积累。. 本研究在类黄酮代谢物鉴定基础上结合转录组分析，初步阐明了睡莲花瓣类黄酮合成的分子机理，明确了参与睡莲类黄酮糖基化修饰的NnGTs的功能，为培育睡莲花色新品种奠定了基础。