黄瓜耐低氮相关基因克隆及功能验证

设施蔬菜栽培中的氮肥过量投入现象是农业可持续发展以及绿色、无公害蔬菜生产面临的主要问题之一。研究耐低氮相关基因表达调控机制，选育出耐低氮的蔬菜新品种则是解决这些问题的根本途径。为全面认识黄瓜耐低氮胁迫的分子调控机理，本项目在前期筛选获得耐低氮黄瓜自交系'D0328-3'的基础上，拟对其进行低氮（正常氮水平的1/5）胁迫处理，进而采用抑制消减杂交（SSH）技术比较处理及对照在低氮胁迫和正常氮水平下基因的表达差异，分离黄瓜耐低氮相关基因，并采用过量表达或RNAi技术对候选基因的功能进行验证。本研究将会为耐低氮黄瓜新品种的分子育种奠定基础，同时也将为其它蔬菜作物耐低氮品种的遗传改良与种质创新，以及植物氮代谢的分子调控机理研究提供理论依据。

为了研究黄瓜耐低氮胁迫的生理与分子机制，在国家自然科学基金青年基金项目（31101545）的资助下，在实验室前期筛选获得黄瓜耐低氮性较高（D0328）和较低（D0422）的种质资源基础上，本项目首先对其氮素吸收、代谢和再循环过程中关键生理和分子生物学指标进行了比较分析，结果表明两黄瓜品种拥有相同的氮素吸收和代谢能力，而耐低氮性较高黄瓜品种同时拥有较高的氮素再循环能力，从而证明氮素再循环在黄瓜耐低氮性过程中发挥着重要作用。在此基础上，利用Solexa测序技术，鉴定出了一批黄瓜耐低氮胁迫相关基因，其中在苗期黄瓜植株的叶片和根中分别鉴定出了1523和1468个耐低氮相关基因，在盛果期黄瓜叶片中鉴定出了764个黄瓜耐低氮相关基因。这些基因主要参与了氨基酸合成、酪氨酸和色氨酸生物合成、植物激素信号传导、E3泛素连接酶等途径。在表达谱分析基础上，分别克隆了CsNRT1.7、CsCDPK、CsGS1、CsNRT1.5、CsSnRK、CsOPT、CsAHP1、CsAOC4、CsMYB21和CsNAC等黄瓜耐低氮相关基因，并对其表达模式进行了分析，结果表明上述基因均参与了黄瓜耐低氮性的调控。在基因分离基础上，对黄瓜耐低氮相关基因CsNRT1.7和CsCDPK的功能进行了分析，结果表明CsNRT1.7通过调控黄瓜叶片衰老阶段的氮素再循环进而控制黄瓜的耐低氮性，从而为人们利用基因工程手段改良黄瓜耐低氮性提供了思路。同时还获得了转CsCDPK基因的黄瓜材料（株系）8个，从而为下阶段改良黄瓜耐低氮性提供了材料。利用Solexa技术，鉴定出了30个黄瓜耐低氮胁迫的marker基因，从而为田间黄瓜植株是否遭受黄瓜耐低氮胁迫的快速诊断提供了技术支持。通过上述研究，本项目获得了3755个黄瓜耐低氮相关基因，对2个可显著提高黄瓜耐低氮胁迫能力的新基因的功能进行了分析，获得了8份转黄瓜耐低氮相关基因的转基因黄瓜材料，申请发明专利2项，发表文章6篇，其中SCI期刊1篇，培养硕士研究生3名，本项目研究成果为耐低氮黄瓜新品种的分子育种奠定了一定基础，同时也为其它蔬菜作物耐低氮品种的遗传改良与种质创新，以及植物氮代谢的分子调控机理研究提供了一定理论依据。