p63对角膜缘干细胞衰老的影响及其调控通路的研究

角膜缘干细胞对保持角膜的透明性与正常生理功能具有重要意义。随着年龄的增长，动物角膜缘干细胞的细胞比例减小，增殖能力下降，呈现老化趋势。这势必会对其生理功能造成一定的影响。本项目通过构建急性角膜缘干细胞衰老的动物模型，在体分析角膜缘干细胞衰老对角膜上皮老化的影响；并建立2月龄角膜缘干细胞p63缺失和3年龄角膜缘干细胞p63过表达细胞模型，从正反两方面论证p63在角膜缘干细胞衰老过程中的作用；利用p63缺失的细胞模型分析p63缺失与各相关衰老基因表达变化的关系，探讨其衰老调控通路及其结构域。本项目的开展将明确角膜缘干细胞衰老对角膜组织老化的影响、p63调控角膜缘干细胞衰老的信号通路及其作用结构域，从而加深对角膜缘干细胞衰老发生机制的认识，为角膜缘干细胞衰老的干预、相关眼表疾病治疗和预防提供新的思路。

角膜缘干细胞( Limbal Stem Cells，LSCs)位于角膜缘上皮的基底层，是角膜上皮细胞增殖的储备力量，它不断增殖、分化，取代脱落的细胞以维持角膜上皮细胞数目的平衡；此外，角膜缘干细胞还可以阻止结膜上皮细胞和新生血管移行至角膜表面，这对于保持角膜的透明性与正常生理功能具有重要意义。随着年龄的增长，研究发现新西兰兔角膜缘干细胞的细胞比例减小，增殖能力下降，呈现老化的趋势，这势必会对其正常的生理功能造成一定的影响。p63是LSCs的阳性标记物，研究发现它在不同年龄段大鼠的角膜缘表达各不相同，这提示p63可能在LSCs衰老过程中发挥着一定的调节作用。研究p63在LSCs衰老过程中到底扮演什么样的角色，又是通过什么样的信号通路来调节衰老是角膜缘干细胞研究领域重要任务。p63的重要活化功能亚单位， ΔNp63是否参与调控角膜缘细胞衰老进程中的增殖、分化以及信号转导等作用目前知之甚少。为此，本课题以不同年龄兔LSCs 作为研究对象，在基因水平和蛋白水平探讨LSCs 衰老进程中ΔNp63表达变化及调控作用。研究结果表明，随年龄增长，1.0年龄和3年龄体外培养兔LSCs细胞增值能力明显降低；伴随LSCs增值能力降低，ΔNp63在蛋白水平以及mRNA水平也显著降低，提示ΔNp63在角膜缘干细胞衰老进程中有调节作用。应用ΔNp63缺失干预2月龄兔LSCs的细胞模型，结果发现不仅显著抑制LSCs的增值能力，且p63相关衰老基因调节信号通路p63-p53-p21-Rb的基因p53、p21蛋白和mRNA水平表达表现为抑制性降低。研究结果提示ΔNp63与LSCs 衰老相关，ΔNp63调节LSCs衰老相关通路是p63-p53-p21-Rb。后续将通过慢病毒、腺相关病毒载体转染等实验，继续深入研究ΔNp63过表达、干扰，是否可提高在体、体外LSCs的增值能力，进而明确p63对LSCs衰老的调节机制及信号通路。