马与驴的绒毛膜促性腺激素糖基化位点差异研究

Horses and donkeys are two species of equids, which are capable of secreting unique placental hormone equine and donkey Chorionic Gonadotropin among domestic animals, however, the biological activity of equine and donkey Chorionic Gonadotropin is different significantly. To investigate the glycosylation sites of significant differences affecting the biological activity of the hormone, the equine and donkey Chorionic Gonadotropin will be extracted and purificated by metaphosphoric acid precipitation, ammonium sulfate condense and ethanol precipitation, followed by detecting the biological activity of LH and FSH and anti-degradation in vitro and in vivo. The glycosylation sites and key sites to biological activity of donkey CG will be conducted by hydrazide chemistry and hydrophilic affinity method, LC-MS / MS mass spectrometry, bioinformatics analysis with control of equine CG. The aim is identification, comparison and exploring the function of horse and donkey CG glycosylation sites, in order to reveal the molecular mechanisms of biological activity differences of horse and donkey Chorionic Gonadotropin, enrich the theory of protein glycosylation for mammalian.

马与驴同为马属动物，能够分泌家畜中特有的妊娠胎盘激素“马和驴绒毛膜促性腺激素”，然而马和驴绒毛膜促性腺激素的生物活性却差异显著。为探讨对该类激素生物学活性显著影响的糖基化位点差异，本项目拟通过偏磷酸沉淀、硫酸铵浓缩、乙醇分步沉淀、过柱等手段提取并纯化马和驴绒毛膜促性腺激素，接着进行体外、体内的LH和FSH生物活性和抗降解检测。以马绒毛膜促性腺激素为对照，采用酰肼化学法和亲水亲和法，经LC-MS/MS质谱鉴定、生物信息学分析驴绒毛膜促性腺激素的糖基化位点分布及对生物活性起关键作用的位点。本项目以马和驴绒毛膜促性腺激素的糖基化位点鉴定、对比、功能为探索目标，将揭示马和驴绒毛膜促性腺激素的生物功能差异的分子机制，丰富哺乳动物蛋白的糖基化理论。

马与驴同为马属动物，能够分泌家畜中特有的妊娠胎盘激素“马和驴绒毛膜促性腺激素（eCG和dCG）”，然而马和驴绒毛膜促性腺激素的生物活性却差异显著。为探讨对该类激素生物学活性显著影响的糖基化位点差异，本项目通过生物信息学预测eCG-β和dCG-β的结构特征和N/O糖基化位点，偏磷酸沉淀、层析柱等步骤提取并纯化eCG和dCG，检测生物活性，酶解、LC-MS/MS质谱鉴定、生物信息学分析鉴定蛋白质糖基化位点分布，LC-MS/MS质谱对血清进行蛋白质组学鉴定分析，结果发现eCG-β和dCG-β均在13氨基酸位点发生N-糖基化，dCG-β有14个氨基酸位点发生O-糖基化，且在128氨基酸位点发生O-糖基化的可能性最大。eCG的平均生物活性为dCG的2.24倍，经过分步提纯，从孕马血清和孕驴血清中分别纯化得到纯度较高的eCG和dCG制品，eCG比活为1490.33IU/mg，活性回收率为52.14%；dCG比活为1284.27IU/mg，活性回收率为50.25%，可进一步进行糖基化位点鉴定，同时为今后生殖激素CG产品的提纯生产提供了技术依据。鉴定发现dCG-β和eCG-β均在13氨基酸位点（天冬酰胺Asn）上发生N-糖基化，但dCG-β的N-糖基化位点被H5N2、H6N2、H7N2和H8N2共4种高甘露糖型N-糖链所修饰，eCG和dCG生物活性差异的原因与N-糖基化位点修饰的糖链特征差异有关。马和驴妊娠血清中的显著差异表达蛋白共76个，驴与马相比，其中上调蛋白48个，下调蛋白28个；仅两者之一拥有的差异表达蛋白189个，其中仅在妊娠驴血清中表达的蛋白89个，仅在妊娠马血清中表达的蛋白100个。马和驴妊娠血清中的差异表达蛋白主要集中于免疫代谢、酶活性、营养代谢等信号通路，驴可能在免疫、抗病等方面比马具有先天的物种优势。CG在马、驴生殖过程中与促乳素信号通路、GnRH信号通路、卵巢类固醇生成、神经活性配体-受体联结有关。本项目为进一步明确马和驴绒毛膜促性腺激素的生物功能差异的分子机制，丰富哺乳动物蛋白的糖基化理论提供了一部分参考。