M3乙酰胆碱受体组成型激活在非小细胞肺癌生长过程中的作用研究

Acetylcholine (Ach) was found to have growth factor-like effect, and could promote the progression of tumor. Among the Ach receptor family members, M3 receptor and its signal transduction were proved to be more important during this process. To date, there are fewer studies on the possible manner and signal pathway through which Ach and its receptor system affect tumor progression. In our previous studies, we have found that pharmacological antagonizing and knock-down of M3 receptor significantly inhibited the proliferation of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells, the mechanism was related to induction of G0/G1 phase arrest through downregulation of Cyclin D1-CDK4/6 and decreasing of Rb phosphorylation. Antagonizing M3 receptor also resulted in downregulation of Akt phosphorylation and upregulation of JNK phosphorylation. Based on these results, we will investigate and validate the constitutive activation of M3 receptor and potential mechanisms underlying the involvement of M3 receptor in NSCLC cellular growth, proliferation,apoptosis and migration. This study is to provide evidence for ascertaining the role of non-neuronal cholinergic system in the tumor growth process and assigning an alternative of combination strategy for NSCLC therapy in the future.

近年研究发现乙酰胆碱具有生长因子样作用，能促进肿瘤发展进程。在众多的胆碱受体中，M3受体及其介导的信号通路居于更重要的地位。然而，迄今为止有关内源性乙酰胆碱及其受体系统影响肿瘤进程的方式和信号机制的深入研究报道较少。我们在前期研究中发现，采用药理学手段拮抗或敲减M3受体能显著抑制非小细胞肺癌的生长增殖，其机制涉及下调Cyclin D1-CDK4/6表达水平、抑制Rb磷酸化，以及诱导G0/G1期阻滞；拮抗M3受体还可下调Akt磷酸化水平，及上调JNK磷酸化。本项目将在前期研究基础上，研究并证实非小细胞肺癌中M3受体的组成型激活，及其参与调控肿瘤细胞生长、增殖、凋亡和迁移的可能方式，为确立非神经元胆碱能系统在肿瘤生长调控中的地位，以及未来可能的NSCLC组合化疗策略选择提供依据。

M3受体（毒蕈碱乙酰胆碱受体）是G蛋白偶联受体的一员，其在非小细胞肺癌（NSCLC）中表达，并与非小细胞肺癌的预后不良密切相关。我们实验室前期发表的论文证明，M3R拮抗剂可以减少NSCLC的增殖。本研究观察了新型的M3受体拮抗剂R2-8018对NSCLC H1299增殖和迁移的影响，进一步说明M3R在H1299细胞生长增殖和转移中的重要地位，解释了M3R参与H1299细胞生长增殖和转移的分子机制。.通过研究，我们发现R2-8018可以剂量依赖性的减少H1299的增殖和迁移，同时Crispr / Cas 9敲除M3R也获得了类似的结果，而给予外源性的乙酰胆碱或卡巴胆碱对H1299的增殖无刺激作用。根据抗体芯片结果，我们发现R2-8018和M3受体敲除，降低了EGFR受体的磷酸化水平。我们通过R2-8018和AG-1478（一种选择性EGFR抑制剂）联合应用检测到，二者联合使用会进一步抑制H1299的增殖和迁移，同时二者的联合使用对H1299的抑制效果要明显强于药物的单独使用。通过上述结果及结合文献调研，我们推测NSCLC中存在着M3R与EGFR之间反式激活或相互串扰的情况，为进一步验证假说，我们通过western-blot实验，发现R2-8018或者M3受体敲除会降低EGFR的1100络氨酸的磷酸化水平，同时会降低GPCR与EGFR相互作用的关键分子SRC529位络氨酸的磷酸化水平，而对arrestin1和2的影响很小。通过R2-8018拮抗和敲除M3R能够有效抑制PKC和EGFR蛋白的表达以及MEK/ERK1/2和PI3K/AKT通路的活性，而对P38MAPK影响较小，对细胞多个细胞周期蛋白（Cyclin）和周期依赖性激酶（CDK）的抑制作用显著，升高了细胞周期依赖性激酶抑制因子（CDKI）的表达，也降低了细胞基质金属蛋白酶2（MMP2）的表达。.通过研究，我们发现拮抗和敲除M3R能够显著抑制H1299细胞的生长增殖和迁移，引起H1299细胞发生G0/G1期阻滞。拮抗和敲除M3R能抑制M3R与EGFR之间相互作用的SRC的的磷酸化，抑制EGFR的磷酸化，最终通过抑制细胞周期的进程而发挥肿瘤抑制作用，并通过降低MMP2的表达，抑制H1299细胞的迁移。本研究可为确认M3受体作为抗肿瘤靶标提供依据，为M3R拮抗剂和EGFR拮抗剂联合用药靶向治疗非小细胞肺癌提供依据。