木犀草素经IRE1通路修复炎症性肠病肠屏障损伤的实验研究

Recent studies have revealed the intestinal mucosal barrier dysfunction is the molecular basis of the presence of inflammatory bowel disease (IBD). Both the defect of endoplasmic reticulum stress (ERS) and autophagy are associated with the injury on intestinal mucosal barrier in IBD. It suggests that therapeutics protecting intestinal barrier may be a promising strategy for the treatment of IBD. Our previous research proved perilla frutescence extract which main biologically active ingredient is luteolin has the function of protecting intestinal barrier, regulating gastrointestinal movement and anti-inflammation. Both the domestic and foreign research shows that luteolin is useful in treatment and prevention of experimental colitis model. Acute colitis will be induced in Wistar rats with 5%DSS. We will observe changes in mRNA and protein expression of GRP78, XBP1, IRE1, JNK, ATG16L1, LC3, P62 in colic mucosa, pathologic changes of colic mucosa, autophagosome, intestinal epithelium apoptosis. We will measure the effect of luteolin on protecting intestinal barrier and treating IBD through regulating ERS-autophagy steady in IRE1 pathway. The study will reveal the correlation of the regulating effect of luteolin on ERS, autophagy in intestinal epithelium with the function of protecting intestinal mucosal barrier, and provide experimental basis for IBD treatment in clinic.

近期研究显示，肠黏膜屏障功能障碍是炎症性肠病（IBD）发病的分子基础，内质网应激和细胞自噬缺陷都与IBD肠屏障损伤相关。提示保护肠屏障有可能是治疗IBD有前景的途径。课题组前期研究表明，以木犀草素为主要有效成分的紫苏提取物有保护肠屏障、调节胃肠运动、抗炎等作用。国内外研究指出木犀草素对实验性IBD确有疗效。在此基础上，本项目拟采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导大鼠急性结肠炎模型，观察结肠黏膜组织GRP78、XBP1、IRE1、JNK、ATG16L1、LC3、P62mRNA和蛋白表达，结肠黏膜组织病理、细胞自噬体，结肠黏膜上皮细胞凋亡，阐释木犀草素通过IRE1通路调节内质网应激-自噬稳态，保护肠黏膜屏障进而治疗IBD的作用。揭示木犀草素调节肠上皮细胞内质网应激、自噬和肠黏膜屏障保护作用之间的相关性，为临床IBD的治疗提供实验依据。

炎症性肠病以消化道慢性复发性炎症和黏膜组织损伤为特征，其病因病机尚未完全阐明。本研究从IRE1/JNK通路入手，探讨木犀草素调控内质网应激-自噬稳态保护肠黏膜屏障治疗IBD的作用机制。采用DSS诱导制备小鼠结肠炎模型，观察结肠黏膜GRP78、XBP1、IRE1、JNK、ATG16L1、LC3、P62 mRNA和蛋白表达，结肠黏膜组织病理，超微结构，阐明木犀草素通过IRE1/JNK通路调节内质网应激-自噬稳态，保护肠屏障的分子作用机制。结果显示：1．DSS诱导小鼠结肠炎模型自由饮用DSS 5天后，DAI评分显著升高，结肠病理改变。木犀草素可改善小鼠DAI评分，改善结肠黏膜病理。2．模型小鼠结肠黏膜组织GRP78、IRE1α、XBP1mRNA和蛋白表达均显著降低（P＜0.01），p-IRE1α蛋白表达明显增加（P＜0.01）。木犀草素可显著上调GRP78、IRE1α、XBP1mRNA表达水平，增加GRP78、IRE1α蛋白表达，降低了DSS引发的p-IRE1α蛋白表达增加。对XBP1蛋白表达有增加趋势但无统计学意义。3．与正常组比较，模型组ATG16L1mRNA表达显著降低（P＜0.01），JNKmRNA表达显著增加（P＜0.01）。ATG16L1、P62、LC3A、LC3B、p-JNK蛋白表达水平增加，JNK蛋白表达无明显差异。木犀草素可显著提高ATG16L1mRNA表达水平（P＜0.01），同时下调模型组JNKmRNA表达增加（P＜0.01）。木犀草素可使模型小鼠P62、LC3A、LC3B、p-JNK蛋白表达水平明显下降，对ATG16L1和JNK蛋白表达均无明显影响。4．TUNEL法检测结肠黏膜上皮细胞凋亡，结果显示模型组结肠上皮隐窝处有大量的棕色阳性细胞分布，正常小鼠仅有少数。木犀草素低、中、高浓度可不同程度改善肠黏膜细胞凋亡。 5．透射电镜下观察发现，正常小鼠未见自噬体及自噬溶酶体。模型小鼠出现超微结构异常，高倍镜下可见大量自噬体和自噬溶酶体。木犀草素低、中、高浓度组除有超微结构的改善外，均可见少量自噬体。以上研究结果提示，内质网应激-自噬IRE1/JNK通路可能参与了IBD的发病。木犀草素经IRE1/JNK通路调控内质网应激-自噬稳态，进而保护肠黏膜上皮细胞稳态，维护肠屏障功能和完整性，发挥其治疗IBD的作用。