线粒体氧化应激介导的铁死亡在早期急性肝衰竭发生发展中的作用及其机制研究

Acute liver failure (ALF) is a fatal condition hallmarked by rapid development and limited treatment. The etiology of ALF is various, among which acute drug-induced liver failure is the most common one. Recent studies suggest that in the process of ALF, in addition to apoptosis and necrosis, there may be ferroptosis characterized by increased ROS and disordered iron metabolism. In the previous experiment, we analyzed 97 patients with ALF and found that iron metabolism was related to the age in the initial stage of liver failure. In addition, through the animal model of ALF, we proved the participation of ferroptosis in the early ALF, a short-term compensatory increase of energy metabolism-related proteins and genes and a gradual decrease of GPX4, the main regulator of ferroptosis, after midterm of ALF. Therefore, we hypothesized that in the early stages of ALF, the compensatory increase of mitochondrial function would promote ferroptosis without GPX4 and led to the liver failure subsequently. This research intends to establish the ALF model of rats and primary hepatocytes, through specific antagonist, small interfering RNA and application of metabolomics, fluid cytology techniques to explore the involvement of ferroptosis in ALF, providing new strategies for treatment.

急性肝衰竭（ALF）是一种致死率高，进展迅速但治疗手段有限的危重症。ALF病因多种多样，其中药物性为最常见的一大类。近来有研究认为在ALF的过程中除了凋亡和坏死之外，可能存在着以ROS增多、铁代谢紊乱为特征的铁死亡。前期实验我们收集分析了97位ALF患者的临床资料，发现肝衰竭初期铁代谢紊乱与年龄相关。此外，通过动态观察ALF的动物模型，我们发现在ALF早期就会发生铁死亡，能量代谢相关蛋白及基因在早期有代偿性的升高，而铁死亡主要调节因子GPX4在ALF中晚期才逐渐下降。因此，我们提出假设：在ALF早期，线粒体功能代偿性升高，会通过独立于GPX4以外的通路介导促进铁死亡，进而导致肝衰竭。本项目拟建立大鼠及原代肝细胞模的急性肝衰竭型，以RNA干扰、特异性拮抗剂为干预手段，通过精准代谢组学、流式细胞学等方法，从分子、细胞、动物整体等不同层面研究线粒体能量代谢及铁死亡在急性肝衰竭过程中的作用机制。

大量肝细胞死亡是急性肝衰竭的病理生理基础，但肝细胞死亡的方式尚未完全阐明。铁死亡是近年来报道的一种新的细胞死亡方式，其在急性肝衰竭发病机制的作用尚不清楚。本项目组利用肝衰竭小鼠模型和肝细胞损伤模型研究了这一重要问题。首先通过在肝衰竭过程中动态检测小鼠血清及肝脏的铁死亡相关指标如谷胱甘肽（GSH）、脂质过氧化物（MDA）以及胱氨酸/谷氨酸转运体（xCT）、核受体共激活因子4（NCOA4）等，发现铁死亡在APAP处理早期即被激活，后逐渐衰退。而经典的GPX4在APAP引起的铁死亡过程中并非关键的通路介导蛋白。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可延长生存时间，但不能改善最终结局。伴随着铁死亡激活，线粒体首先出现皱缩，长短径、面积均减小，后期发生肿胀，长短径、面积增加，逐渐出现膜电位丢失，细胞合成ATP含量下降，蛋白含量减少，提示APAP所致肝损伤过程中线粒体损伤是与铁死亡相关的关键事件之一。进一步通过猪急性肝衰竭模型的血清蛋白组学发现线粒体氧化应激相关蛋白呈显著改变，其中视黄醇结合蛋白（RBP4）在猪和小鼠急性肝衰竭模型的血清中显著持续下降，而在急性肝衰竭小鼠肝脏中呈先下降后上升的趋势，其主要表达于肝细胞，且表达区域集中于中央静脉周围。在小鼠模型及L02肝细胞系模型中发现RBP4单独可造成肝细胞损伤，而在与APAP共同处理后，肝细胞损伤明显加重，且线粒体形态改变和功能损伤最为明显。进一步研究发现RBP4协同APAP可诱导Beclin-1从细胞质转位至线粒体膜，而激活线粒体自噬会在改善线粒体功能、抑制肝细胞死亡的同时减少Beclin-1的转位现象。总的来说，本项目研究结果发现铁死亡是APAP诱导的急性肝衰竭的早期事件，线粒体损伤是铁死亡事件的重要标志，RBP4是介导肝细胞线粒体损伤的重要蛋白，从而为APAP诱导的急性肝衰竭提供了一个潜在治疗靶标。