代谢工程改造枯草芽孢杆菌合成N-乙酰神经氨酸关键问题的研究

N-acetylneuraminic acid (NeuAc) is one of the most important sialic acid, which has been widely used as nutraceutical and drug intermediate with wide range of applications and market. Microbial fermentation is a promising method to produce NeuAc in green and sustainable manners compared to traditional extraction method and chemical synthesis approach. However, unknown effects of different NeuAc synthetic pathway on glycolysis, insufficient dephosphorylation of intermediate N-acetylglucosamine-6-phosphate (GlcNAc6P), and imbalance between NeuAc synthesis and cell growth limit efficient NeuAc production. In this project, we plan to solve the abovementioned problems. To this end, we plan to use a GlcNAc overproducing B. subtilis strain BSGN as the initial host, which was obtained from our previous work. Firstly, effects of NeuAc aldolase pathway and NeuAc synthase pathway on glycolysis will be investigated for balancing NeuAc synthetic pathway and glycolysis. Next, mechanism of dephosphorylation of intracellular phosphosugar will be studied to identify and verify key phosphatase for GlcNAc6P dephosphorylation. Finally, to obtain the optimal strategies for balancing NeuAc synthesis and cell growth, metabolic flux distribution of central carbon metabolism and NeuAc synthetic pathway will be optimized. The strategy developed in this project and mechanism elucidated in this study will be useful for unraveling regulation mechanism of related pathway and metabolic engineering for other nutraceutical production.

N-乙酰神经氨酸(NeuAc)是一种重要的唾液酸类化合物，作为营养化学品和药物中间体具有广泛的应用。微生物发酵法是替代传统提取法和化学合成法实现绿色、可持续生产NeuAc的重要方法。然而由于不同NeuAc合成途径对糖酵解途径的影响不明确、中间代谢产物N-乙酰氨基葡萄糖-6-P(GlcNAc6P)去磷酸调控机制未知，以及NeuAc合成与细胞生长不平衡这三个问题的存在，导致NeuAc合成效率低。本课题针对以上三个问题，以申请人前期研究中得到的一株产GlcNAc重组枯草芽孢杆菌作为出发菌株，解析NeuAc合成途径对糖酵解途径的影响，平衡NeuAc途径与糖酵解途径；揭示枯草芽孢杆菌磷酸糖去磷酸调控机理，获得GlcNAc6P高效磷酸酶，平衡NeuAc合成途径；调控碳中心代谢途径，平衡细胞生长与NeuAc合成。本研究采用的策略与阐明的相关机制将为代谢调控其它营养化学品合成途径的提供方法和理论上的参考。

N-乙酰神经氨酸(NeuAc)是一种重要的唾液酸类化合物，作为营养化学品和药物中间体具有广泛的应用。微生物发酵法是替代传统提取法和化学合成法实现绿色、可持续生产NeuAc的重要方法。然而由于不同NeuAc合成途径对糖酵解途径的影响不明确、中间代谢产物N-乙酰氨基葡萄糖-6-P(GlcNAc6P)去磷酸调控机制未知，以及NeuAc合成与细胞生长不平衡这三个问题的存在，导致NeuAc合成效率低。本项目枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为研究对象，首先，通过构建NeuAc合酶(NeuB)和NeuAc醛缩酶两条合成途径，发现NeuB途径可以获得0.33 g/L的NeuAc；通过在基因组和质粒上表达关键酶AGE和NeuB实验发现，质粒表达产量达到0.33 g/L，显著高于在基因组表达水平的0.05 g/L。其次，筛选验证了分别来源于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的共6个去磷酸化酶，发现仅有来源于大肠杆菌的YqaB酶是以GlcNAc6为底物，当在枯草芽孢杆菌中过表达YqaB时，NeuAc、ManNAc和GlcNAc分别提升36.4%、96.5%和35.4%，至0.45 g/L、0.28 g/L和0.88 g/L。然后，通过模块化工程将GlcNAc和磷酸烯醇式丙酮酸模块的不同供应强度进行组合，当GlcNAc和PEP模块都达到最高强度时，NeuAc产量和合成速率分别为1.65 g/L，显著提高NeuAc合成效率。最后，通过敲除丙酮酸激酶（Pyk），弱化中心代谢，引入异源ED途径，平衡细胞生长和产物合成，使NeuAc产量达到1.87 g/L；进一步通过选取不同强度RBS，微调YtsJ基因表达，优化苹果酸对于PEP和丙酮酸供给的平衡，使得NeuAc产量最终达到2.18 g/L，葡萄糖得率提高到59.82 mg/g。本项目完成了产NeuAc食品安全级菌株枯草芽孢杆菌的构建，为发酵法规模化制备N-乙酰神经氨酸奠定了基础。同时，本项目阐明的机理和相关代谢工程改造策略将为其它营养化学品的代谢调控机理研究提供方法和理论上的参考。