小麦孢囊线虫膜联蛋白Ha-ANNEXIN抑制寄主防御反应的机制解析

Parasitism genes encoding secreted effector proteins of plant-parasitic nematodes play important roles in facilitating parasitism. Cereal cyst nematode Heterodera avenae is an obligate sedentary plant parasitic nematode. Our previous study showed that an annexin-like gene Ha-annexin from H. avenae was transcribed within the subventral gland cells of the pre-parasitic second-stage juveniles. It most likely encodes a secreted protein playing important roles during early parasitism. Using transient expression assays in Nicotiana benthamiana, we found that Ha-ANNEXIN could suppress plant defense, at least PAMP-triggered immunity (PTI). In addition, Ha-ANNEXIN targeted a point in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway downstream of two kinases MKK1 and NPK1 in N. benthamiana. Based on these results, the study here will demonstrate that Ha-ANNEXIN could suppress host defense by transient expression assays in wheat; discover its interacting protein in wheat by yeast two-hybrid assays and biomolecular fluorescence complementation (BiFC); analyze the interaction sites; explore function of the interacting protein, including its timal and spacial expression pattern by qRT-PCR and plant subcellular localization, and its impact on nematode parasitism and plant defense by knocking down the gene.

植物寄生线虫可分泌一系列效应因子到植物细胞中行使多种功能促进寄生。前期研究业已明确，植物寄生线虫——小麦孢囊线虫Heterodera avenae中的膜联蛋白基因Ha-annexin在亚腹食道腺细胞表达，可能编码一个在寄生前期起主要作用的分泌蛋白；烟草瞬时表达Ha-ANNEXIN显示其可抑制植物防御反应，至少是PTI反应，且其作用靶标位于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中MKK1和NPK1基因的下游。基于这些结果，本研究拟利用小麦瞬时表达系统验证Ha-ANNEXIN对寄主防御反应的影响；采用酵母双杂交、双分子荧光互补等方法鉴定Ha-ANNEXIN在寄主体内的互作蛋白；分析Ha-ANNEXIN与互作蛋白的作用位点；通过qRT-PCR、亚细胞定位分析该互作蛋白的表达时空；敲除互作蛋白分析其对线虫寄生的影响，以及对植物防御反应相关MAPK通路和激素通路的影响，从而确定其功能。

植物寄生线虫可分泌一系列效应因子到植物细胞中行使多种功能促进寄生。前期研究业已明确，植物寄生线虫——小麦孢囊线虫Heterodera avenae中的膜联蛋白基因Ha-annexin在亚腹食道腺细胞表达，可能编码一个在寄生前期起主要作用的分泌蛋白；烟草瞬时表达Ha-ANNEXIN显示其可抑制植物防御反应，至少是PTI反应，且其作用靶标位于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中MKK1和NPK1基因的下游。基于这些结果，本研究对Ha-ANNEXIN抑制植物防御反应的机制进行了进一步的解析。通过烟草瞬时表达系统，明确了Ha-ANNEXIN的四个annexin功能结构域均可以抑制植物防御反应；Ha-ANNEXIN可以抑制小麦孢囊线虫自身效应因子激发的烟草叶片细胞坏死，暗示Ha-ANNEXIN可以与小麦孢囊线虫中其他效应因子相互作用共同影响植物防御反应；构建了线虫侵染后小麦根系的酵母文库，采用酵母双杂交的技术初步筛选了13个候选互作基因；通过分析小麦根系-线虫互作早期的转录组数据，未发现Ha-annexin的差异表达，推测Ha-annexin在该时期尚未表现明显的作用，另外，我们发现该时期小麦根有93个差异表达基因（27个上调，66个下调），线虫有879个差异表达基因（867个上调，12个下调），而线虫的差异基因中有若干个预测效应因子基因上调表达，其中的一个类几丁质酶效应因子基因通过烟草瞬时表达系统表明可以抑制植物防御反应。本研究结果将为小麦孢囊线虫的防控提供技术支撑。