细胞层工程结合基因修饰再生颞下颌关节滑膜的研究

颞下颌关节紊乱病（Temporomandibular disorders，TMDs）是临床上的常见病和多发病。TMDs会导致颞下颌关节滑膜不同程度的病理改变。当滑膜出现不可逆的病变时，关节的润滑功能和营养功能被破坏，加重了颞下颌关节的退行性改建。目前尚无有效方法修复病损滑膜。利用多能干细胞移植再生修复病变滑膜是一种有意义的尝试。研究表明透明质酸合成酶2基因可以促进滑膜细胞高分子量透明质酸的合成，从而提高关节润滑和营养功能。本项目研究颞下颌关节滑膜来源和骨髓来源的间充质干细胞对滑膜再生的具体作用，通过慢病毒载体介导的透明质酸合成酶2基因对种子细胞进行修饰，利用先进的细胞层工程（Cell sheet engineering）技术体外构建滑膜样组织。通过已建立的TMDs动物模型，植入体外构建的滑膜样组织，探讨此条件下颞下颌关节滑膜修复与再生的过程和机理，为今后TMDs的治疗提供了新思路。

背景：颞下颌关节紊乱病（Temporomandibular disorder，TMD）是临床上的常见病和多发病。当滑膜出现不可逆的病变时，关节的润滑功能和营养功能被破坏，加重了颞下颌关节的退行性改建。本实验利用组织工程修复滑膜，并通过基因转导的方式制造出具有更强分泌透明质酸功能的滑膜细胞。.主要内容：1.研究体外不同HAS2表达水平的种子细胞构建的滑膜样组织的生物学特性。从滑膜细胞中提取RNA并逆转录成cDNA，设计引物，成功得到人透明质酸合成酶2（HAS2）基因全长片段并将人HAS2基因插入质粒PET-28a，构建重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌中，观察重组蛋白的表达情况和活性。构建人工滑膜方面，利用滑膜中的主要细胞外基质成分一型胶原与滑膜细胞，通过层叠的方式制造出具有三层细胞结构的人工滑膜。.2.研究由种子细胞构建的滑膜样组织与健康TMJ滑膜组织的生物学特性的差别。对三层结构的组织工程滑膜进行体外增殖检测、透明质酸（HA）分泌量的检测、扫描电镜和透射电镜观察、透明质酸合成酶（HAS2）的检测。.3.将构建的人工滑膜组织、一型胶原和脱细胞真皮植入裸鼠皮下，分析其植入体内的生物学特性。植入裸鼠皮下两周，观察三层结构的细胞层在模拟体内环境下的分泌功能和降解情况。 .重要结果及关键数据：基因转导方面，成功获得人HAS2基因并构建了PET-28a-HAS2重组质粒和PET-28a-HAS2-EGFP重组质粒。构建EGFP-HAS2融合蛋白原核表达质粒。通过细胞表面标志的鉴定，证实本实验所用细胞为B型滑膜细胞。成功构建出具有三层滑膜细胞结构的细胞层，即人工滑膜。苏木素伊红染色和透射电镜观察，发现人工滑膜与天然滑膜在层次结构与形态上相似。在透射电镜下观察，发现人工滑膜与天然滑膜均不具备细胞连接器，如桥粒、半桥粒。体外功能检测方面，发现三层结构的细胞层相比对照组具有更多的HA分泌量和HAS2的表达，并且细胞有在层状的结构中增殖更快。裸鼠皮下移植实验发现，人工滑膜能在体内环境存活2周，并且原有的一型胶原成分被宿主的成纤维细胞侵入并分泌胶原，并有血管的长入，使原有的人工滑膜在结构、成分上更像天然的滑膜组织。 .科学意义：本实验第一次通过组织工程技术构建细胞层模拟颞下颌关节滑膜组织，为治疗颞下颌关节紊乱病提供了新的方法。