基于核酸适配体的百草枯残留快速检测与去除研究

Paraquat was widely used as an efficient herbicide in agriculture over the past few decades. Due to improper use of paraquat, some adverse issues like pesticides residues and incidents of human poisoning have attracted people’s attention in recent years. The current technologies for paraquat detection and separation usually need complicated operations and expensive instruments, so they can not meet the demands of rapid and on-site residues assay or removal. Aptamer exhibits many advantages and has been regarded as an ideal recognition tool for biological detection and separation. Unfortunately, there still lack any report involving in the aptamer-based technology for the detection and removal of paraquat residues. In this project, we will adopt our previous strategy of “a novel SELEX method for aptamer toward small molecules without enough sites for immobilization”, for the selection of aptamers with high affinity to paraquat. The distinguished feature of our SELEX method is immobilizing ssDNA libraries rather than target molecules on a matrix. We will choose some functional nanoparticles like carbon dots (CDs) and gold nanoparticles as sensing signals of fluorescent, colorimetric and Rayleigh resonance scattering (RRS), and investigate the interactions among aptamers, nanoparticles and targets, thus propose several rapid detection methods for paraquat residues existing in agricultural and sideline products. Moreover, we will also employ the selected aptamer as an affinity ligand, to prepare functional materials for the efficient removal of paraquat residues in some special samples.

百草枯作为高效除草剂被长期广泛应用于农业生产中，由于使用不当等原因造成农产品残留超标、人体中毒等一系列突出问题。现有百草枯检测和分离技术存在如操作繁琐、依赖大型仪器等多方面缺陷，难以满足原位快速检测和去除的实际需求。核酸适配体作为识别分子展现出诸多优势，在生物检测和分离方面有广阔的应用潜力。遗憾的是目前还缺少有关核酸适配体技术进行百草枯残留检测和去除的报道。本项目以申请人前期提出的“无固定化点靶标的适配体筛选方法”为基础，将随机ssDNA库固定在介质上，先筛选出百草枯的高亲和性核酸适配体，并以其作为识别分子，再选择碳量子点(CDs)、金纳米颗粒(AuNPs)等纳米粒子作为信号输出载体，发展几种快捷的荧光、比色、共振散射等检测信号，建立基于核酸适配体的农副产品百草枯残留快速分析方法。此外，本项目还将筛选的核酸适配体作为亲和配体，制备相应的分离材料，实现对特定环境中百草枯残留的有效去除。

核酸适配体具有蛋白抗体类似作用，在靶标特异性识别上越来越受到重视，已被广泛应用于各种小分子、生物大分子甚至整个细胞的检测。小分子物质通常与环境污染和人类健康密切相关，然而小分子物质与核酸文库在性质上差异较小，在筛选过程中没有足够的活性位点难以固定，因而其核酸适配体筛选难度更大。百草枯属于小分子高效除草剂，毒性极大且口服中毒死亡率极高，因而有必要对其在农产品中的残留进行超灵敏检测。虽然近年来核酸适配体技术在农药检测领域取得一些进展，但是还未见利用该技术检测百草枯的报道。本项目先采用体外合成一条生物素修饰的碱基序列，通过氢键与随机文库3’-末端进行互补配对，将其固定在链霉亲和素修饰的纳米磁珠上。随后加入不同浓度的百草枯靶标进行孵育，通过洗脱得到百草枯的亲和性ssDNA，对其进行非对称PCR扩增后得到下一轮筛选所需的富集ssDNA库。经过9轮筛选后将所得亲和性ssDNA进行克隆测序，最后得到15条百草枯的亲和ssDNA序列。对亲和性序列进行聚类分析和二级结构预测，再根据同源性等条件从中挑选出6条ssDNA序列进行亲和力测定。结果表明PQ-15序列对百草枯的亲和力最高，其对靶标的解离常数(Kd)为(54 ± 4) nmol/L。最后利用PQ-15核酸适配体作为百草枯的识别分子，以阳离子化合物聚集的胶体金(AuNPs)作为传感信号，建立了基于核酸适配体识别的百草枯农药比色检测方法，检测限为25.2 nmol/L，其它竞争性靶标对百草枯检测无明显干扰，实际样品中百草枯的加标回收率为91.13% ~99.60%。此外，本项目开展了核酸传感信号的设计与检测应用研究。选择AuNPs、二硫化钨纳米片、氧化锰纳米颗粒、氯化血红素等作为比色信号材料，着重研究了它们的形态、成分、元素价态、底物种类等对其模拟酶活性的影响，并直接与危害物作用或通过功能性核酸序列对催化反应进行调控，从而建立了一系列危害物比色检测新方法。选择碳量子点(CDs)作为荧光信号，利用AuNPs和胶体银(AgNPs)作为荧光猝灭剂，并通过核酸适配体对荧光猝灭作用进行调控，从而建立了一系列危害物荧光检测新方法。