核酸生物传感器应用于水体中镉和砷的检测研究

The pollution caused by heavy metals in water has became more and more serious in China, and the present methods for the detection of heavy metals can not meet the demands of the rapid and on-site assay. Aptamers have more superior characteristics than other biologic tools such as antibodies and enzymes, and they are now becoming the leading field in the area of heavy metals detection. However, the aptamers selection methods for heavy metals need to improve, and the signals output techniques for nucleic acids based biosensor also need to enhance. In this project, we will employ a novel systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) procedure to select the aptamers with high affinity to cadmium. We firstly immobilize the random ssDNA pools on the surface of modified agarose macroparticles. The ssDNA with affinity to cadmium will be obtained by washing the above immobilized agarose macroparticles with different concentration of cadmium. After several positive and negative SELEX selections, the aptamers with high affinity to cadmium can be obtained. We will research several novel signals output techniques, including colorimetric technique based on aptamers and cationic polymers, resonance scattering (RS) technique based on aptamers and cationic dyes, to develop simple and rapid signals methods for nucleic acids based biosensor detection. The main aim of this project is to develop several novel nucleic acids based biosensors for the detection of cadmium and arsenic in aqueous solution.

我国水体重金属污染问题十分突出，而现有的重金属检测方法难以满足快速、原位检测的实际需要。核酸适配体具有蛋白类抗体和生物酶无法比拟的优势，其在重金属方面的检测已成为国内外一个重要的前沿方向和研究热点。然而现有的重金属适配体筛选技术还不完善，与之对应的核酸传感器信号表达技术还需要进一步改进。本项研究将采用新型固定化SELEX筛选技术，将随机ssDNA库固定在琼脂糖颗粒上，通过不同浓度的镉离子洗脱出亲和性ssDNA序列，经过多轮正负筛选，得到镉离子高亲和力核酸适配体。通过研究基于适配体、多价阳离子聚合物和阳离子有机小分子的新型比色信号和共振散射信号技术，开发出简单、快捷的核酸传感器信号表达技术，再结合筛选到的镉离子核酸适配体和已有的无机砷核酸适配体，建立水体中镉离子和无机砷的核酸传感器快速检测新方法。

核酸适配体作为识别配体具有分子量较小、可化学合成、稳定性好、没有毒性等优点，已经被广泛应用于各种小分子、生物大分子甚至整个细胞的检测。虽然近年来核酸适配体技术在重金属检测领域取得一些进展，但是还未见利用该技术检测砷和镉的报道。本项目通过筛选或者选用已报道的核酸适配体作为镉和砷的识别配体，利用三苯甲烷染料、氯化血红素、金纳米粒子等作为信号输出载体，建立了基于核酸适配体技术的三价砷和镉离子检测新方法。本项目取得的主要研究进展如下：(1)建立了一种适用于无固定化点靶标的核酸适配体筛选方法，并利用该方法筛选到镉离子的核酸适配体(Cd-4 aptamer)，其对镉离子的解离常数(Kd)为34.5 nM。本项目建立的核酸适配体筛选方法拥有自主知识产权(授权专利号ZL2013100638446)，可以为其它小分子靶标的适配体筛选提供借鉴。后续工作以Cd-4 aptamer作为识别配体，利用基于阳离子聚合物的纳米金高效比色信号，实现水体中镉离子的灵敏检测。(2)研究了砷核酸适配体和三苯甲烷染料分子的作用机制，结果证实它们在一定条件下可以自组装成纳米粒子，通过改变二者的比例可以得到粒径不同的纳米粒子，而后续加入三价砷会使得纳米粒子的粒径发生变化，从而导致整个体系的瑞利共振散射信号显著变化，在此基础上建立了三价砷的高灵敏检测新方法。本方法可以为那些长链核酸适配体传感体系的设计提供借鉴。(3)研究了核酸适配体与氯化血红素的相互作用，建立了一种有效调控氯化血红素辣根过氧化物酶活性方法，在此基础上发展了一种适用于三价砷检测的比色技术，其可以为利用核酸适配体检测其它物质提供新的途径。本项目的实施进一步拓展了核酸适配体技术在重金属检测领域的应用范围，而项目实施过程中建立的方法和发展的技术可以为核酸传感体系的设计及应用提供借鉴。本项目完成后已发表SCI论文3篇，并获得授权专利2项。