艾灸调节溃疡性结肠炎肠道菌群多样性及艾灸血清对其LPS信号通路的作用机制研究

Early research has shown that moxibustion adjust intestinal flora imbalance in UC rat. On this basis, the UC clinical research combined with the corresponding experiments on animals, from two aspects in vivo and in vitro, this study aims to: (1) Using 16 s RNA gene sequences and fluorescence quantitative PCR techniques, observation the change of intestinal flora diversity and the content and expression OF peripheral and colon immune effect factors in UC patients and UC rat, and on LPS signal pathway upstream LPS, LBP and CD14 content, the expression of TLR4 transmembrane protein, channel on key molecules, and the expression of inflammatory factors, to explore the effcet of moxibustion on UC intestinal flora diversity and LPS signal pathways, (2) By the application of proteomics technology, study the main active components of moxibustion serum of UC, (3) Using cell culture and laser confocal imaging techniques, observation of proinflammatory factor in mononuclear cells, Th1 and Th2 cytokines released, as well as of the expression of the LPS mediated inflammatory factors and inflammatory signaling molecules in moxibustion serum, to explore the effect of moxibustion serum on the immunoregulatory effects of LPS mediated inflammatory response, explain the mechanism of biological effect of moxibustion and perfect the moxibustion technology in the treatment of UC, improve the clinical curative effect.

前期研究表明，艾灸可调节UC肠道菌群失衡状态。在此基础上，本研究旨在：采用UC临床研究结合相应动物实验，从体内和体外研究两方面：（1）采用16s RNA基因序列和荧光定量PCR等技术，观察艾灸对UC患者和大鼠肠道菌群多样性、外周和结肠免疫效应因子的含量和表达，以及LPS信号通路上游LPS、LBP及CD14含量、跨膜蛋白TLR4的表达，通路上关键分子，以及下游炎症因子的表达，研究艾灸对UC肠道菌群多样性及LPS信号通路的调节作用，（2）应用蛋白质组学技术，研究艾灸UC血清的主要活性成分，（3）采用细胞培养和激光共聚焦成像等技术，观察艾灸血清单核细胞促炎因子和Th1与Th2型细胞因子释放，以及对LPS介导的炎症因子及炎症信号分子的影响，研究艾灸血清对LPS介导的炎症反应的免疫调节作用，阐释艾灸治疗UC的生物效应机制，完善艾灸治疗UC的临床技术，提高其临床疗效。

本研究采用基因组学和蛋白质组学技术，从肠道菌群多样性和LPS信号转导通路以及艾灸血清的主要活性成分及其对LPS信号通路的免疫调节作用等角度开展研究。结果发现，（1）UC模型大鼠的肠道菌群多样性降低，艾灸可以逆转UC大鼠肠道异常的细菌种属，增加UC大鼠肠道菌群的多样性；艾灸可引起氨基酸代谢通路基因增加，长时间艾灸可增加抗坏血酸盐和糖二酸代谢。（2）UC大鼠血清多种差异细胞因子蛋白主要涉及免疫系统反应过程、细胞迁移、生物粘附等生物过程，艾灸组涉及CC类趋化因子受体相互作用通路等；艾灸可下调MCP-1、Agrin、TCK-1、MMP-8、LIX五种显著差异细胞因子在UC大鼠血清中的高表达。（3）艾灸血清均可下调UC大鼠血清、LPS加UC模型大鼠血清和LPS刺激诱导PBMCs产生的IL-6、TNF-α、IFN-γ,上调IL-4、IL-13，以及下调anti-CD3抗体活化的PBMCs中T细胞诱导产生的IL-6、TNF-α的水平，上调IL-10、TGF-β的水平。（4）艾灸可下调UC大鼠外周血sIgA、LPS、TNF-α及其受体1和2、IL-2、IFN-γ、IL-17和IL-23的含量，上调IL-10、TGF-β、IL-2的含量；艾可上调UC大鼠结肠黏膜IL-10、TGF-β、IL-2、IFN-β的表达，下调LBP及CD14、TLR4的表达以及MAPK、MyD88、IKK、IRF-3、TRIF、IRAK和TNF-α及其受体1和2、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23的表达。（5）艾灸均能明显减轻UC患者腹痛、腹泻、黏液脓血便等临床症状，改善肠道黏膜组织病理学损伤、Mayo积分和生活质量IBDQ评分。（6）健康志愿者的肠道菌群物种丰度和多样性指数明显高于UC患者；艾灸治疗后的肠道菌群物种丰度和多样性指数明显高于治疗前。（7）艾灸可上调UC患者外周血NK细胞的活性，下调LPS、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-10的含量，可上调结肠黏膜IL-10、TGF-β、IL-2、IFN-β的表达，下调LBP及CD14、TLR4、MAPK、MyD88、IRAK、TRAF6和下游TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。该研究进一步揭示了艾灸治疗UC的生物效应机制，完善了艾灸治疗UC的临床技术，有利于提高其临床疗效。