精确可控的人毛乳头细胞三维拟生态共培养体系的构建及其调控机制研究

Human dermal papilla cell (hDPC) is the most important cell in construction of tissue when engineering hair follicle. In vitro studies have shown that three-dimensional culture are beneficial to maintain its specific properties and functions, but most of these methods only used for spatial rearrangement of DPCs, which is far from the simulated micro-environment in vivo. In vivo, DPCs are physiologically surrounded by blood vessels and a large number of extracellular matrix (ECM), forming into a multi-cellular spheroid tissue. Our recent studies have confirmed that the layer-by-layer self-assembly (LbL) technology can further enhance the biological function of nano-bionic ECMs in a single mouse DPC, and construct the bionic micro-tissue of mouse DPCs through chemical cross-linking, which simulates to some extent. In vivo microenvironment. Based on this, this project intends to establish a three-dimensional pseudo-ecological co-culture system that can precisely regulate the size of the sphere and contain hDPC, endothelial cells, ECM and related growth factors through LbL and hanging drop culture techniques, in an attempt mimic the in vivo microenvironment. At the same time, high-throughput transcriptions sequencing was used to screen the key genes regulating the biological function of hDPCs in the three-dimensional pseudo-ecological system, and the mechanism of micro-environment system regulating the biological function of hDPCs was clarified, which provided effective mechanism for tissue construction and its regulation mechanism in hair follicle regeneration platform.

人毛乳头细胞（hDPC）是毛囊再生的关键种子细胞，但在体外培养中会逐渐丧失其功能。虽然三维培养利于其特性及功能的维持，但目前大多方法只是将hDPC进行空间结构上的重排，距模拟体内微环境差之甚远。正常人体内hDPC聚集成球形，周围有血管和大量细胞外基质（ECM）包绕。我们近期研究证实，通过层层自组装（LbL）技术为单个鼠DPC构建纳米级仿生ECM后能进一步增强其生物学功能，并通过化学交联构建出了鼠DPCs仿生微组织，一定程度上模拟了体内微环境。据此，本课题拟通过LbL和悬滴培养技术，建立可精确调控成球大小并含有hDPC、内皮细胞、ECM及相关生长因子的三维拟生态共培养体系，以尝试更加有效地模拟体内微环境。同时利用高通量转录组测序筛查三维拟生态体系中调控hDPCs生物学功能的关键基因，明确微环境体系调控hDPCs生物学功能的作用机制，为毛发再生中的组织构建及其调控机制研究提供有效平台。

临床中秃发患者逐渐增多且呈年轻化趋势，无论是药物还是手术治疗均不能再生出新生毛囊，通过组织工程毛囊的构建以实现毛囊再生为秃发的治疗带来希望。虽然目前尚未在体外构建出完整的组织工程人毛囊，但研究表明三维培养有助于细胞形成类器官样结构。然而，对于毛囊再生的关键种子细胞——毛乳头细胞（DPC），目前组织工程毛囊的构建方法大多只是将其进行空间结构上的聚集重排，并未按照毛乳头生理结构加入内皮细胞构（HUVEC）建血管，也未构建细胞外基质（ECM），仅靠DPC自身少量分泌，距离模拟体内微环境差之甚远。我们近期研究证实，通过层层自组装（LbL）技术为单个鼠DPC构建纳米级仿生ECM后能进一步增强其生物学功能，并通过化学交联构建出了鼠DPCs仿生微组织，一定程度上模拟了体内微环境。据此，本课题拟通过LbL和悬滴培养技术，建立可精确调控成球大小并含有人DPC、内皮细胞、ECM及相关生长因子的三维拟生态共培养体系，以尝试更加有效地模拟体内微环境。首先，我们通过LbL技术成功包裹人DPCs及HUVECs，并为其构建了纳米级仿生ECM。其次，通过Ca2+化学交联LbL-DPCs和LbL- HUVECs成功构建富含ECM及血管的vascular DP。研究表明，与HUVECs共培养后，可解决微组织内部缺氧诱导的细胞坏死。最后，通过动物实验及转录组检测证实，与传统的三维培养相比，纳米级仿生ECM和血管化的构建可进一步恢复DPCs的转录特性，并显著提高DPCs的毛发诱导效率。我们新颖的高仿生组织工程策略是恢复人DPCs毛发诱导能力的关键进步，并为构建未来临床可用的人DP微组织提供了新方法。