糖基化修饰影响木质素-纤维素酶结合机制及酶理性改造

The unproductive adsorption of cellulase to lignin restricts the bioconversion of lignocellulose. Cellulase is the main enzyme used in cellulose degradation. Construction of “weak-lignin-binding” cellulase, through molecular engineering of protein surficial properties, is a valid way to release the lignin restriction. The cellulases secreted by filamentous fungi are often decorated with N- and O-glycosylation, which is reported to affect the surficial properties, activity and stability of cellulase. Previous studies also suggest the role of glycosylation in lignin-cellulase interaction, but the mechanisms are not fully understood. In this project, we investigate the consensus maps of cellulase glycosylation and examine the roles of glycosylation in lignin binding behavior. By molecular dynamic simulations, it clarifies the mechanism of glycosylation participating in lignin-cellulase interaction on the molecular binding level. On this basis, the glycosylation sites of cellulase are rationally modified and the cellulases, with "weak-lignin-binding" and high-efficiency, are screened by analysis of its binding and hydrolysis properties. This study has important reference value for improving the understanding of lignin-cellulase binding mechanism, enriching the "weak-lignin-binding" cellulase engineering strategy, and further constructing high-efficiency cellulose degrading enzymes.

木质素与纤维素竞争性的结合纤维素降解酶，是阻碍生物质转化的重要因素。纤维素酶是纤维素降解的主要酶，改造酶表面特征，构建“弱木质素结合”的高效纤维素酶是降低木质素阻碍的有效手段。糖基化修饰在真菌分泌的纤维素酶中普遍存在，是影响酶表面特征的重要因素。蛋白糖基化修饰的改造，是构建“弱木质素结合”高效纤维素酶的有效策略，但目前相关研究基础较弱。本项目拟系统研究糖基化修饰位点和糖型对木质素-纤维素酶结合行为的影响，结合蛋白和木质素特征，阐明糖基化修饰影响木质素-酶结合的机制。通过分子动力学、分子对接、蛋白模拟突变，解析糖基化修饰酶与木质素的结合构象，筛选主要糖基化位点及结合能最低的蛋白突变策略。在此基础上，理性改造纤维素酶，构建“弱木质素结合”的高效纤维素酶。本项目的实施，对完善木质素-纤维素酶结合机制，丰富“弱木质素结合”纤维素酶改造策略，进一步构建高效纤维素降解酶等具有重要参考价值。

木质素与纤维素竞争性的结合纤维素降解酶，是阻碍生物质转化的重要因素。纤维素酶是纤维素降解的主要酶，研究木质素-纤维素酶的结合性质和机理可指导构建“弱木质素结合”的高效纤维素酶，是降低木质素阻碍的有效手段。本项目对木质素-纤维素酶相互作用的行为和机理，尤其是纤维素酶糖基化修饰对木质素-纤维素酶吸附的影响，进行了研究。结果表明，有机溶剂（四氢呋喃THF）预处理可有效脱除木质素，但残余木质素和溶解木质素对纤维素酶的非生产性吸附均增加。但由于其固体底物中残余木质素较少，因此减少溶解木质素是进一步提高酶解效率的可行途径。此外，THF溶出木质素表面孔洞增加，比表面积高，表面电荷多，是理想的吸附剂材料。在此基础上，研究蛋白糖基化修饰对THF木质素-纤维素酶吸附行为和机理，发现真菌分泌纤维素酶蛋白表面具有多个糖基化修饰位点，糖型复杂。本项目通过质谱手段揭示了草酸青霉分泌酶系中主要蛋白CBHI, EGII 和BglI表面O-糖和N-糖修饰位点及可能的糖型，并对N-糖修饰糖链结构进行了预测。通过生物信息学模拟分析N-糖修饰蛋白与木质素吸附行为和机理研究发现，糖基化修饰改变了蛋白与木质素的结合行为，增加了结合的能量，减少了木质素-纤维素酶的结合，该现象在纤维素酶蛋白中普遍存在。因此，将糖基化修饰程度增加的CBM V27E,P30D,Link1区融合到EGII蛋白，构建的融合蛋白与木质素的吸附明显降低，酶解效率明显增加。同时，构建的高糖基化修饰Gly-EG蛋白具有较高分子量，其与木质素的吸附也明显降低。本项目的实施，揭示了糖基化修饰作为影响蛋白表面特征的重要因素，如何参与木质素-纤维素酶的结合，并发现增加蛋白糖基化修饰程度可有效降低木质素-纤维素酶的结合，对“弱木质素结合”纤维素酶的改造提供了重要的参考。