里氏木霉中酪蛋白激酶II在纤维素酶表达调控中的作用及调控机制的研究

Protein phosphorylation is one of the most important and common mechanisms of regulating the activities of transcription factors, and one of the hot research topics in biological sciences. Casein kinase II (CKII) is a protein kinase that was shown to interact with many transcription factors. The function of CKII in signal transduction pathways has been identified in human and yeast, while few studies on the role of CKII in the regulation of cellulase synthesis in Trichoderma reesei were reported. In this proposal, we have raised a hypothesis that CKII participates in the regulation of cellulase production by phosphorylating and activating Cre1 for the induction of carbon catabolite repression (CCR), and showed the validity of this hypothesis by our preliminary work. To further identify the mechanism of this regulation, the role of CKII subunits and holoenzyme in regulating cellulase production will be investigated, the protein-protein interaction between CKII and transcription factors will be examined, and the phosphorylation sites of the transcription factors will be identified with bioinformatics. Moreover, we will investigate the molecular mechanism on cellulase expression regulated by phosphorylation with site-directed mutagenesis. We aim to establish a new approach for genetic modification of T. reesei, and promote new technologies that remove the carbon catabolite repression in filamentous fungi and enhance cellulase production.

蛋白质的磷酸化是调节转录因子活性的最为普遍和重要的机制之一，其相关研究是当今生物科学领域中的一个热点。酪蛋白激酶(CK)II 是一种与多种转录因子相互作用的蛋白激酶，它在人体细胞和酵母信号传导中的作用已经清晰，但在里氏木霉纤维素酶合成机理的研究领域中鲜见报道。本项目提出了“里氏木霉中的CKII通过磷酸化以Cre1为代表的转录相关因子调控纤维素酶的表达，尤其是通过调控碳源代谢阻遏效应（CCR）介导菌体对外界碳源信号的反应”的假说并被前期工作初步验证。本项目中CKII 各亚基和全酶在里氏木霉中的功能将被鉴定，验证里氏木霉的纤维素酶转录调控相关因子与CKII 各亚基或全酶之间的蛋白质相互作用 ，通过生物信息学软件已经预测了转录相关因子上的磷酸化受体部位并用定点突变的方法解析磷酸化修饰参与纤维素酶转录调控的分子机制，提供里氏木霉基因工程改造的新理论指导，并创建新型的纤维素酶高产技术。

碳源代谢阻遏效应（CCR）是阻遏丝状真菌中纤维素酶转录的重要因素之一，但是里氏木霉的CCR如何被外界碳源信号调控的分子机理尚不清晰。蛋白质的磷酸化是调节转录因子活性的最为普遍和重要的机制之一。本项目研究了 CKII亚基在转录因子Cre1的磷酸化过程中的功能，完成了里氏木霉中调控因子Cre1的磷酸化修饰参与 CCR 的分子机制的研究，建立了磷酸化转录因子Cre1调控纤维素表达的分子模型。本项目的实施，成功构建了丝状真菌基因敲除遗传操作平台-Cre-loxP +Tet-on无痕遗传操作技术；明确了里氏木霉中的酪蛋白激酶(CK)II不仅调控了里氏木霉的菌体生长，而且对转录因子Cre1的磷酸化调控了纤维素酶的转录；采用生物信息学软件对Cre1进行了磷酸化位点预测，发现了在C端的连续磷酸化保守位点，通过精确定位地将Cre1的S388位的去磷酸化减缓了CCR，提高纤维素酶的转录水平，促进了纤维素酶的产量；并利用纤维素酶降解薯类生物质，成功地发酵生产乙醇和葡萄糖酸。本项目证明里氏木霉是通过磷酸化信号通路传导外界碳源信号的反应，调控细胞内的纤维素酶转录。进一步，依据磷酸化的位点推测可能是PKA (cyclic AMP (cAMP)-dependent protein kinase A的磷酸化修饰参与 CCR，完善了丝状真菌的蛋白表达代谢调控网络和纤维素酶的诱导合成模型。. 通过本项目发现的磷酸化转录因子调控纤维素表达的分子模型，指导里氏木霉基因工程改造，改变了里氏木霉工业菌株转录因子磷酸化修饰，大幅度提高了里氏木霉纤维素酶产量，开拓纤维素酶生产的创新技术。