携载rhBMP-4基因温敏壳聚糖纳米粒成骨效应与机制的研究

细胞因子在修复骨缺损中有重要意义。但目前的细胞因子载体如支架材料或微球存在包封率低，细胞因子活性与表达时效不高，成骨量少，制约骨组织工程研究的发展。本项目运用纳米载体的细胞因子包封率高，稳定性强和作用时间长等优点，结合壳聚糖良好的生物相容性与可降解性，探讨一种核壳结构的壳聚糖纳米缓释载体｛其核为携载骨形态发生蛋白（rhBMP-4）基因的双亲性壳聚糖纳米粒，壳为具有温敏与缓释作用的羟丁基壳聚糖｝提高成骨效应的机制。该纳米粒结合了壳聚糖的基因载体、缓释与温敏三方面优点，壳层在体内形成温敏凝胶，延长包埋的基因载体在体内的缓释释放时间；同时携带的rhBMP-4基因载体的核转染细胞提高成骨蛋白的表达时效。该壳聚糖纳米粒能被注射或与种子细胞、支架材料复合后植入机体骨缺损局部提高成骨量。本研究有望成为大块骨缺损的修复的一个新思路

骨组织工程的基因治疗研究已多年，进展缓慢，面临诸多问题，如：病毒或脂质体等基因载体毒性高，难于临床应用；以往的基因治疗只能实现基因转染的瞬时表达，细胞因子活性与表达时效都不高。因而开发低毒、高表达时效的基因载体是将来基因治疗能够用于骨组织工程临床的前提条件。本项目以具有优异生物相容性的天然高分子壳聚糖作为基因载体材料，通过对其进行功能化修饰，得到巯基烷基化壳聚糖（TACS）、羟丁基壳聚糖（HBC）和PEG修饰的羟丁基壳聚糖（EG-HBC）等三种衍生物，将此衍生物与骨形成蛋白基因（BMP4）一起组装成具有基因缓释功能的核壳结构纳米粒，并将其用于骨缺损的修复。经过四年的探索研究，本项目取得了以下重要进展：（1）成功制备了没有细胞毒性的三种壳聚糖衍生物TACS、HBC和EG-HBC。TACS可以保持与DNA的有效结合能力；HBC及EG-HBC在水溶液中加热至37 oC时，溶解度下降，从水中析出，呈现出羟丁基壳聚糖的温度敏感特点；（2）成功制备了具有生物活性的核壳结构的纳米粒，方法是分别以增强型绿色荧光蛋白基因(pEGFP)、BMP4基因、BMP4-EGFP融合基因为模板基因（pDNA），在水溶液中实现了pDNA与TACS的复合（pDNA-TACS）——核结构，然后在核结构外面包裹具有温敏性的HBC或EG-HBC—壳结构，形成具有核壳结构的pDNA-TACS@HBC和pDNA-TACS@EG-HBC复合纳米粒子。对其生物安全性、在HEK293T和Hela细胞内基因转染行为进行了详细的表征和评价。结果发现该核壳结构基因载体的细胞毒性非常低，可以实现所携载基因在1个月内的可持续释放（壳聚糖缓释作用），并且有较高的基因转染效率；（3）将制备的携载pEGFP基因的核壳结构纳米粒注入小鼠的骨骼肌，通过荧光显微镜、流式细胞仪以及Western blot实验对基因载体的体内转染性能进行了深入研究。结果发现EGFP蛋白可在骨骼肌组织中进行持续表达。证实了所制备的基因载体确实具有基因缓释功能，同时体内转染效率也较高。（4）构建兔双侧桡骨18 mm长的临界骨缺损模型，植入携载BMP4基因核壳纳米粒的异体脱细胞骨支架材料，于术后2、4、8、12周分别通过大体观察、X线、三维CT、苏木精-伊红组织学染色、骨密度以及生物力学测定等进行观察。实验组骨缺损在骨痂形成，骨性愈合程度，皮质骨连续性等方面均明