粘细菌新型β-1,3-葡聚糖酶的催化机制研究

β-1, 3-glucanase has broad application prospects in plant pathology, feed, wine, food and pharmaceutical industry and other fields, so it's significant to explore excellentβ-1, 3-glucanase. We cloned a novelβ-1, 3-glucanase from Corallococcus sp. EGB, it exhibits high catalytic efficiency and special substrate specificity. This enzyme contains a fascin domain and a catalytic domain of glycoside hydrolase family 16 (GH16). The function of fascin domain in GHs is still unknown, the hydrolysis activity to xylan for GH16 β-1, 3-glucanase hasn't been reported and the mechanism of multifunctional enzyme with single catalytic domain is not well understood. In this study, we will elucidate the function of fascin domain and its mechanism of the effect on enzyme properties by domain separation and crystal structure analysis. According to the sequence alignment, structure analysis and molecular docking, the key amino acids which influence the catalytic efficiency and substrate selectivity are confirmed by site-directed mutagenesis. This research will not only provide new ideas for studying the mechanism of multifunctional enzyme with single catalytic domain, and also lay the foundation for the molecular improvement of GHs.

β-1,3-葡聚糖酶在植物保护、饲料、酿酒、食品和医药工业等领域具有广泛的应用前景，因此发掘性能优良的β-1,3-葡聚糖酶具有十分重要的意义。本课题组克隆获得的新型β-1,3-葡聚糖酶具有高效的催化效率和特殊的底物选择性。该酶含有一个Fascin结构域和一个GH16催化结构域。目前Fascin结构域在整个糖苷水解酶家族中的功能未知，GH16家族β-1,3-葡聚糖酶水解木聚糖的功能也未见报道，同一催化结构域水解多种底物的催化机理尚不明确。本项目拟采用结构域截短表达和晶体结构解析，阐明Fascin结构域的功能及其对β-1,3-葡聚糖酶催化特性的影响机制；基于序列比对，结构分析和分子对接，利用定点突变技术研究影响酶催化效率和底物选择性的关键氨基酸。该研究将为单催化结构域多功能酶催化机理的研究提供新的思路，为糖苷水解酶的分子改造奠定基础。

本课题组从粘细菌Corallococcus sp. EGB中克隆获得编码437AA，分子量为47.04 kDa的新型β-1,3-葡聚糖酶LamC。基因结构分析表明LamC的1-26 位为信号肽，N端含有一个Fascin-like结构域，C端为GH16家族催化结构域。本研究尝试不同表达载体，不同培养条件，不同表达宿主，密码子优化和mRNA的二级结构的优化等策略，最终通过构建Origami B(DE3)(pET-32a-lamC)表达菌株，实现了LamC在大肠杆菌中的异源表达。采用不同结构域的截短表达，rLamC和催化结构域rLamC-△N的酶学性质表明Fascin-like结构域在 LamC的可溶性表达，稳定性和β-1,3-葡聚糖类底物的催化效率等方面具有重要作用。Fascin-like结构域rLamC-△C的底物结合实验进一步验证了该非催化结构域具有特异性识别和结合可溶性的和不可溶性的β-1,3-葡聚糖类底物，但不具备Fascin蛋白中的Fascin-like结构域结合F-actin的能力，属于一个新型的具有专一性结合β-1,3-葡聚糖的碳水化合物结合域（CBMs）。底物谱特异性表明LamC具有非常独特的催化特性，该酶以外切型的水解方式切割β-1,3-或-1,6-葡聚糖类底物，以内切型的水解方式水解β-1,4-葡聚糖或木聚糖类底物。活性中心关键氨基酸的定点突变表明LamC的多功能催化活性均由同一活性中心完成。通过蛋白质结晶条件的筛选和优化，成功获得了可供衍射的Native-rLamC和Se-rLamC的的蛋白质晶体。同时，通过同源建模的方法获得了催化结构域rLamC-△N和Fascin-like结构域rLamC-△C的三维结构，结构显示rLamC-△N具有TIM折叠桶结构，较大的底物结合口袋从而有利于结合分子量较大的多糖底物，因此具有较广的底物谱水解活性。本研究首次阐明了Fascin结构域在糖苷水解酶家族中的功能，揭示了LamC单一活性中心多功能活性的机制，为糖苷水解酶的改造和应用研究奠定了基础。