我国高致病性2型猪链球菌引发链球菌中毒性休克综合症的分子机制研究

1998年和2005年分别在江苏和四川发生两起猪链球菌2型（SS2）流行感染人和猪的公共卫生事件，临床病人出现了国内外从未报导过的中毒性休克综合征（STSS），病死率可高达80％以上。本课题组对现场分离强致病菌株进行全基因组测序和组功能注释，发现两次流行分离的致病株均携带一条独特的89 kb核酸片段（命名为89K），结构完全符合毒力岛特征，对89K上的一个二元信号转导系统（SalK/SalR）的敲除也证实其同SS2中国株的致病性密切相关。我们进一步分析发现89K的序列中编码着一个Ⅳ型分泌系统（T4SS），T4SS广泛参与细菌毒力因子在宿主中的扩散过程，在激发宿主产生天然免疫炎症应答过程中起到决定性作用。因此，本课题旨在通过一系列生物学手段，从分子水平、细胞水平和动物水平三个层面探讨89K上的T4SS系统在我国高致病性SS2中的致病作用，揭示其与STSS之间的内在联系。

2型猪链球菌（SS2）是一种新发的人兽共患传染病病原体，不仅给养猪业造成巨大经济损失，而且严重威胁公共卫生安全。近年我国突发的两次SS2大规模流行和链球菌中毒性休克综合征（STSS）这一新的临床类型的出现，提示我国高致病性SS2已经发生了毒力变异。本项目前期通过比较基因组学研究发现我国高致病性SS2含有一个独特的毒力岛89K，该毒力岛的存在很可能与STSS的发生有着密切的联系。本项目通过进一步分析发现89K 中编码着一个Ⅳ型分泌系统（T4SS），在成功构建T4SS关键组分VirD4-89K和VirB4-89K的基因敲除突变株后，我们通过动物实验证实T4SS功能缺失导致SS2毒力显著减弱，感染动物后造成的病理损伤程度显著减轻，同时突变株刺激宿主产生炎性因子的能力也大大降低。随后我们利用蛋白质组学技术，分析了野生株和T4SS缺失株胞外蛋白的差异表达谱，鉴定出7个通过T4SS分泌的候选效应蛋白，并证实其中一个类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶SspA-1能刺激宿主产生过度炎性免疫应答，是重要的毒力因子。本项目研究结果证实我国高致病性SS2毒力岛89K上的T4SS是STSS形成的重要机制，T4SS通过跨膜转运SspA-1等效应蛋白刺激宿主产生过度炎性免疫应答，引发炎症因子瀑布效应，从而造成机体广泛病理损伤，最终导致STSS形成。.另外，在本项目的支持下，我们还开展了以下实验研究：①通过实验证实荚膜唾液酸是重要的毒力因子，在宿主对SS2识别与应答中发挥抑制作用；②荚膜唾液酸可抑制宿主免疫细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路的激活，藉此参与细菌逃避宿主的免疫防御作用；③根据SalK、virB4-89K、cps2J基因保守区域建立了SS2多重Real-time PCR检测体系。④菌毛BP蛋白可能参与SS2与宿主间的相互作用，对细菌感染致病过程中起着易化作用；⑤菌毛结构亚蛋白SSU0473是SS2膜表面蛋白，具有良好的免疫原性和免疫保护性，可作为SS2亚单位疫苗的候选分子；⑥针对89K毒力岛T4SS建立了特异、灵敏的环介导等温扩增（LAMP）方法。.本项目的研究结果揭示了我国高致病性SS2引发STSS形成的分子机制，推进了SS2致病机理的认识，同时为SS2疫病的预防和流行病学监控提供了理论指导。.本项目研究成果共发表SCI论著4篇，中文论著13篇，2014年获国家科学技术进步二等奖1项。