去泛素化酶USP25特异性抑制TRAF3蛋白降解在Kupffer细胞内毒素耐受中的作用

Under the support of National Natural Science Foundation of China, we have found that endotoxin tolerance inhibited K48-linked polyubiquitination and degradation of TRAF3, activation of downstream MAPK signaling pathway and production of inflammatory factors. The specific molecular mechanism may be associated with up-regulation of deubiquitinating enzymes (DUBs). As a member of DUBs family, ubiquitin specific protease 25 (USP25) is the unique enzymes mediating deubiquitinated of TRAF3 protein. USP25 suppresses degradation of TRAF3 by specifically removing K48-linked ubiquitin chains from TRAF3. Therefore, we hypothesize that USP25 may participate in the endotoxin tolerance induction, but the underlying mechanism is unclear.This study is to explore the impact of usp25 gene deletion on endotoxin tolerance using wild type and USP25 -/- mice. Moreover, changes of TRAF3 ubiquitination, proinflammatory and anti-inflammatory cytokine production is to be observed after over-expression of TRAF3. With the researches above, we will provide evidences to clarify the role of USP25 in endotoxin tolerance of KCs and underlying mechanism, and do some exploratory work for clinical treatment of inflammation associated diseases.

在国家自然科学基金资助下，我们发现内毒素耐受时Kupffer细胞（KCs）内 TRAF3蛋白K48泛素化降解受到抑制，下游MAPK信号激活明显受阻，促进抗炎因子的产生也显著减少，其分子机制可能与去泛素化酶（DUBs）表达增高有关。泛素特异性蛋白酶25（USP25）是DUBs成员之一，是目前发现的唯一能特异性调控TRAF3蛋白去泛素化的分子，它能够特异性识别TRAF3蛋白并将其K48位多聚泛素链水解，从而抑制TRAF3蛋白降解。因此，我们推测USP25可能参与了内毒素耐受的诱导，但具体机制还不清楚。本研究将利用野生型和USP25-/-小鼠，探讨USP25基因缺失后对内毒素耐受的影响；观察过表达USP25基因后TRAF3的泛素化水平、促炎和抗炎细胞因子的变化及规律；阐明USP25在KCs内毒素耐受中的作用及确切机制，为临床治疗炎症相关性疾病做些探索性工作。

TRAF3蛋白的泛素化降解是内毒素刺激KCs后引起炎症反应的关键调控机制。USP25是目前发现的唯一能特异性调控TRAF3蛋白去泛素化的分子，它能够特异性识别TRAF3蛋白并将其K48位多聚泛素链水解，从而抑制TRAF3蛋白降解。研究USP25在KCs内毒素耐受中的作用机制，对预防和治疗脓毒血症有重要意义。本研究将利用尾静脉注射慢病毒敲低小鼠USP25基因，探讨USP25基因缺失对内毒素耐受的影响；观察沉默或过表达USP25基因后TRAF3的泛素化水平、促炎和抗炎细胞因子的变化及规律；探讨USP25在KCs内毒素耐受中的作用及确切机制。.主要发现如下：.1.小鼠KCs在非内毒素耐受模型中TRAF3蛋白逐步降解，而在内毒素耐受模型中TRAF3蛋白维持一定水平。慢病毒沉默小鼠KCs的TRAF3基因后，在内毒素耐受模型中Myd88依赖通路P38和JNK磷酸化增加，IL-1β升高，IL-10降低。.2.非内毒素耐受模型中，LPS诱导KCs中TRAF3的K48位多聚泛素化增加，且USP25表达下降，从而导致TRAF3被降解。过表达KCs中USP25基因，抑制TRAF3的K48位多聚泛素化而稳定TRAF3，抑制下游Myd88依赖通路激活。.3.内毒素耐受模型中，LPS诱导USP25与TRAF3互相作用，稳定TRAF3表达。沉默KCs USP25，TRAF3的K48位多聚泛素化增加而加速其降解，下游Myd88依赖通路激活程度增加，与非内毒素耐受组相似。.4.内毒素耐受模型小鼠尾静脉注射慢病毒敲低USP25，加速TRAF3降解及P38、JNK磷酸化，小鼠肝脏损伤加重，生存率降低。.5.内毒素耐受模型中，在USP25沉默的KCs中过表达TRAF3减轻P38、JNK磷酸化，恢复内毒素耐受性。.综上，本项目证实了维持TRAF3蛋白的表达对内毒素耐受有促进作用，并发现USP25与TRAF3的表达呈正相关。进一步通过基因干扰和co-IP实验证实USP25可以直接与TRAF3蛋白相结合，抑制TRAF3的K48位多聚泛素化而稳定TRAF3表达，是诱导内毒素耐受形成的重要因子。过表达TRAF3可补偿USP25沉默造成的影响，恢复内毒素耐受。