Kupffer细胞中TRAF3调控MAPK及TRIF信号通路诱导内毒素耐受的机制研究

Endotoxin tolerance is one of the most important endogenous protective mechanism in inflammatory response. Our previous study found that Toll-like receptor 4 (TLR4) play a key role in endotoxin signaling transduction; interleukin-1 receptor associated kinase M (IRAK-M) can negative regulation of endotoxin signal transduction and induce endotoxin tolerance.However, what transmutations to TLR4 and IRAK-M downstream signaling molecules in endotoxin tolerant in Kupffer cells (KCs) remained unclear.Recent work has revealed that TRAF3 is a highly versatile regulator that positively controls TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β(TRIF) pathway, but negatively regulates mitogen- activated protein kinase activation. It may be involved in the induction of the LPS tolerance. In this study, we will separate KCs and establish mice's endotoxin tolerant model, detecting the change of TRAF3 gene, protein and ubiquitin levels. The mice were administrated TRAF3-shRNA gelatin nanoparticles or Smac-mimetic(SM), and observed the influence of inhibit TRAF3 expression or its ubiquitin on TLR4 downstream signal transduction molecules,exoression of proinflammatory and anti- inflammatory cytokines.The objective of this study is to clarify whether TRAF3 participate in KCs endotoxin tolerance and the possible mechanism.

内毒素耐受是炎症反应时机体最重要的内源性保护效应之一。我们前期研究发现Toll样受体4（TLR4）在Kupffer细胞（KCs）内毒素（LPS）信号跨膜传导中发挥关键作用；IL-R相关激酶M（IRAK-M）能够负性调节LPS信号传导，诱导LPS耐受；但仍不清楚KCs内毒素耐受时TLR4和IRAK-M下游信号分子发生何种变化及其发生机制。最近研究发现，肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3）能够负性调控MAPK信号通路的激活、正性调节TRIF信号途径的活化，可能参与了LPS耐受的诱导。在本研究中，我们将以KCs为靶细胞，建立内毒素耐受细胞及动物模型，检测TRAF3基因、蛋白及泛素化水平变化；尾静脉注射TRAF3-shRNA明胶纳米粒或SM，判断抑制TRAF3表达或者泛素化后对TLR4下游信号转导分子及促炎、抗炎细胞因子的影响。以上研究将为阐明TRAF3参与KCs内毒素耐受的机制提供实验依据。

肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3）能够负性调控MAPK信号通路的激活、正性调节TRIF信号途径的活化，可能参与了内毒素耐受的诱导，但具体机制不清楚。本项目细胞实验内容为：（1）初步探讨了Kupffer细胞（KCs）内毒素耐受时TRAF3基因、蛋白表达及K-48泛素化水平变化；（2）抑制TRAF3的泛素化降解对MAPK 及TRIF信号激活的影响；（3）下调TRAF3蛋白的表达对KCs内毒素耐受的影响。我们发现：（1）内毒素非耐受时KCs细胞内TARF3基因表达无明显变化，蛋白表达下调，K-48泛素化水平增高;（2）内毒素耐受时KCs细胞内TARF3基因表达无明显变化，蛋白表达上调，K-48泛素化水平明显降低， TRAF3降解受阻。（3）通过构建cIAP2-shRNA的慢病毒质粒降低 KCs细胞内cIAP2蛋白表达量后，能够有效抑制TRAF3蛋白泛素化降解，使TARF3蛋白表达量相对增高，并负性调控MAPK信号激活，正性调控TRIF信号活化，诱导KCs产生内毒素耐受，表现为促炎因子TNF-α及IL-1表达下降，抗炎因子IL-10表达增加。（4）通过构建载有TRAF3-shRNA的质粒降低KCs内TRAF3的蛋白表达可以使内毒素耐受的建立受损，但并不能完全消除内毒素耐受效应。动物实验利用c57/BL6小鼠建立了小鼠内毒素耐受及非耐受模型发现：（1）与非耐受小鼠相比，内毒素耐受小鼠肝细胞变性程度明显减轻，炎症细胞浸润明显减少。（2）内毒素非耐受小鼠肝脏TARF3蛋白表达明显降低，耐受小鼠表达明显增高。（3）给予小鼠TRAF3蛋白K-48泛素化抑制剂SM后，脓毒症小鼠肝脏细胞损伤明显减轻，炎症细胞浸润明显减少，提示抑制TRAF3蛋白泛素化降解可减轻脓毒症小鼠肝损伤。人体实验部分：通过HE染色和免疫组化染色检测正常及胆管炎肝组织。我们发现正常肝组织内TRAF3蛋白呈高表达，而在炎症状态下，肝组织内TRAF3蛋白呈低表达。综上所述，本项目研究结果提示：内毒素耐受时KCs细胞中TRAF3蛋白K-48泛素化降解受阻， TRAF3蛋白表达量增高，MAPK信号激活受到抑制，促炎因子产生减少，抗炎因子产生增多；降低KCs内TRAF3的蛋白表达损害内毒素耐受的建立，但不能完全消除内毒素耐受效应。