TMEM8B-a蛋白在肺癌细胞中降解的分子机制研究

TMEM8B基因是一个与肿瘤的转移的抑制性基因。我们研究发现：TMEM8B基因存在两个蛋白亚型，其中TMEM8B-a蛋白在肺癌中表达下调。将TMEM8B-a基因转染至肺癌细胞，TMEM8B- a蛋白经过蛋白酶体降解，但却不被泛素化。因此，我们认为在肺癌细胞内TMEM8B-a蛋白可能经过一种新的途径降解，在细胞内可能还存在一种新的蛋白分子其作用和泛素分子相似，可以多聚化修饰目的蛋白，并将其带入蛋白酶体降解。为了证实假说，我们采用了免疫沉淀、真核表达加亲和纯化的方法纯，纯化TMEM8B-a蛋白；并用LTQ质谱鉴定TMEM8B-a蛋白被修饰分子；采用构建缺失突变体的方法明确TMEM8B-a蛋白降解和多聚化修饰的关键结构域，并初步研究TMEM8B-a对肺癌细胞恶性行为的影响。这为阐述肺癌的发生发展机制提供了新的实验证据；更为重要的是对蛋白质降解的分子机制提出了新的补充和新的观点。

TMEM8B-a蛋白是一个与肿瘤转移相关的蛋白。前期研究表明，TMEM8B-a蛋白在结肠癌和鼻咽癌中表达下调，并和肿瘤侵袭转移密切相关。在本项目的前期研究中我们发现：TMEM8B-a蛋白在肺癌活检组织以及肺癌细胞系中表达下调；将TMEM8B-a基因稳定转染至A549和H520细胞中，Western Blot检测不到TMEM8B-a蛋白的表达，即TMEM8B-a不能在蛋白水平正常表达，但用real-time PCR 检测却发现TMEM8B-a的mRNA水平上调20倍以上。使用蛋白酶体抑制剂MG-132处理稳定转染细胞后，Western Blot即可检测出TMEM8B-a蛋白的表达，且表达水平随着MG-132浓度的增高而增高。同时，免疫荧光技术检测也发现，10μmol以上浓度的MG-132处理稳定转染细胞24小时可以看到细胞中有荧光出现，且荧光强度随MG-132浓度的增高而增强。同时免疫沉淀实验结果表明TMEM8B-a蛋白在肺癌细胞内不依赖于泛素化的，经蛋白酶体的降解，但是确实又被某种分子多聚化修饰。在本项目的研究中，我们使用免疫沉淀技术和亲和纯化技术分别纯化了TMEM8B-a蛋白，对TMEM8B-a蛋白进行质谱分析发现TMEM8B-a蛋白结合了HSP70蛋白，被HSP70蛋白修饰。但是免疫共沉淀实验反向验证过程中发现HSP70蛋白有可能结合免疫球蛋白，对实验结果造成影响。在进一步实验中我们证实了细胞膜浆连接蛋白Ezrin和TMEM8B-a有交互作用，并且Ezrin介导了TMEM8B-a的降解。随后我们成功构建了TMEM8B-a以及Ezrin各个突变体，免疫沉淀实验证实了7跨膜区结构域是TMEM8B-a降解的关键部位；Ezrin的N-ERMAD(1-296 aa)是介导TMEM8B-a蛋白降解的关键部位；TMEM8B-a的228-273AA部位是和Ezrin结合的关键部位；而TMEM8B-a的274-472AA是蛋白酶降解的关键部位。细胞实验表明Ezrin介导TMEM8B-a的降解可以促进肿瘤细胞的运动和侵袭能力，TMEM8B-a的突变体CO可以不被Ezrin降解从而明显抑制肿瘤细胞的运动和侵袭能力。