分枝杆菌中胆固醇侧链第一次降解循环的体外重构及其机理的研究

Bacterial catabolism of steroid plays an important role in Mycobacterium tuberculosis(Mtb) infection and intracellular survival,and also is widely used in green synthesis of steroidal drugs. In the past ten years, significant progress has been made to approach the mechanism for microbial cholesterol degradation, however,the degradation pathway for side chain of cholesterol and its key reaction of C-C bond cleavage have yet to be clearly defined. In present project, we will focus on one cycle of side chain degradation, and use intermediates of cholesterol side chain degradation as substrates for screening and characterizing putative genes involved in sterol side-chain degradation from upstream to downstream along the degradation pathway, reconstruct the side-chain degradation pathway of cholesterol in vitro. At the meantime, the genes involved in C-C cleavage reaction and the substrates preference and products will be investigated in detail. To distermin the function of the putative genes, the deletion mutants of them will be constructed, and accumulated metabolites of the gene deleted mutants will be checked; In addtion,the relationship between cholesterol side chian cleavage and the synthesis of methyl branched lipid also would be carefully studied. Those data will help us understand the mechanism for nutrients utilization of Mtb inside its host cell.

胆固醇分解代谢在一些胞内寄生菌的侵染和胞内存活过程中起着十分重要的作用，了解其胆固醇降解途径和机理将为该类致病菌的防治提供新的思路和启示，同时有助于促进甾体药物的绿色合成。近年来，有关胆固醇微生物降解的研究取得了可喜的进展，但是其侧链降解途径及其关键步骤C-C键断裂反应，仍未能得到阐明。本研究选取其侧链的第一次降解循环为研究对象，即：胆甾C-8侧链中间产物断裂为C-5侧链的降解反应，首先在侧链降解中间物的获得方面打开突破口，以我们前期制备获得的侧链降解中间产物为切入点，逐步对其下游候选基因进行鉴定和功能分析，实现体外侧链降解途径的重建，揭示胆固醇侧链降解的关键步骤C-C键断裂反应机理；通过敲除突变体的构建和分析，进一步明确其生物学功能和作用机制；同时分析胆固醇侧链分解与细胞壁脂质种类与含量的关系，揭示胞内寄生菌的胆固醇分解代谢在其物质代谢中的作用。

胆固醇分解代谢在一些胞内寄生菌的侵染和胞内存活过程中起着十分重要的作用，本研究成功的开展了一下研究工作：1）新制备获得了多种重要的、难以合成胆固醇降解中间体，包括：5-胆甾-26羧酸-3β羧基，5-胆甾-26羟基-3β羧基，为关键降解酶功能的鉴定奠定基础；2）耻垢分枝杆菌不同条件下转录组分析，揭示了基因表达的差异，为研究胆固醇降解基因的功能提供线索；3）对可能参与胆固醇降解的酰辅酶A合成酶编码基因，包括：fadD19 (MSMEG_5914)、fadD19-2 (MSMEG_2241)、fadD19-4 (MSMEG_3687)、fadD17(MSMEG_5908)、fadD1 (MSMEG_4952)、fadD8 (MSMEG_1098)等进行了克隆、表达和底物偏好性、酶促动力学分析以及反应产物的化学结构分析，揭示了各个酶的底物偏好性；4）根据底物的特异性，成功的设计与合成了分枝杆菌的高效特异性抑制剂：胆甾酯酰AMP结构类似物LCA-AMS；5）对LCA-AMS抑制剂效果进行了评价，结果表明，在较低的浓度下，LCA-AMS能够特异性的抑制胆甾酯酰辅酶A合成酶能够有效抑制多种分枝杆菌的生长，而对其他原核生物（大肠杆菌）和真核生物（酿酒酵母）没有抑制作用；6）对酯酰辅酶A合成酶FadD17进行了晶体结构的解析，通过条件优化，获得了FadD17蛋白结晶，通过X衍射获得了FadD17三维空间结构，对其底物结合位点、ATP结合位点等进行了分析。7）对4个候选基因基因敲除突变体的构建，目前成功获得了4个基因的单一敲除突变体。8）还对3-甾酮-Δ1脱氢酶（KstD）进行了克隆和表达分析。通过本课题的研究，较为系统的分析了胆固醇降解的酰辅酶A合成酶及其特异性，并针对其特异性设计了分枝杆菌高效的选择性抑制剂，对胆固醇降解的酰辅酶A合成酶晶体结构进行了分析，证明胆固醇降解酶可作为分枝杆菌药物作用的靶点，这将为利用胆固醇为胞内碳源的致病菌的防治提供新的思路和启示，同时有助于促进甾体药物的绿色合成。