高效特异靶向HA基因载体系统构建及其转染机理研究

鼻咽癌是一种发病率很高且与遗传易感性、EBV感染相关的上皮细胞性恶性肿瘤。LMP1是EBV编码的目前已被确证的具有瘤基因功能的致瘤蛋白，在鼻咽癌的发病中起着重要作用。 研究已证实靶向LMP1的脱氧核酶能够增强鼻咽癌细胞对放疗的敏感性。因此构建高效特异靶向LMP1 脱氧核酶的基因载体系统是基因治疗鼻咽癌的一种新策略。目前限制其临床应用的关键瓶颈是缺乏安全、高效的基因转染载体。本项目采用水热掺杂的方法将HA制备成多孔且可荧光标记的纳米颗粒，以提高载体的基因携带率和荧光特性，并将靶向LMP1脱氧核酶负载在多孔HA纳米颗粒内形成复合体后，再在其表面枝接黏附肽，增加载体系统对细胞的亲和力，提高载体进入细胞的胞吞作用，从而显著提高载体的入胞效率。最终构建出高效特异靶向LMP1的基因载体系统，大幅度提高HA基因载体的转染效率，为基因治疗鼻咽癌提供新的思路和实验依据。

本项目针对目前基因治疗鼻咽癌缺乏安全、高效的特异靶向基因载体这一问题，以提高纳米羟基磷灰石基因载体的转染效率为核心，采用水热合成发制备了介孔荧光纳米HA基因载体，并进行了生物学评价。结果表明.（1）研究表明表面活性剂对HA晶粒形貌无显著影响,但对孔结构的形成具有明显的作用。无表面活性剂存在时，晶粒比表面积只有33m2/g,，无明显的孔结构。而有表面活性剂存在时， HA纳米棒很多孔径大小约2-7nm的开孔。氮气吸附-脱附曲线均为吸附IV型等温线，并伴有明显的滞后环，说明介孔结构的存在。当CTAB与HA的摩尔比为1:2时，样品的比表面积与孔容最大，比表面积为97.1 m2/g，孔容为0.466cc/g。.（2）随着Tb含量由lm01％增到5m01％，颗粒形貌由短棒状转为不规则短棒状与针状，且荧光性能有显著增强。pH值由6．5增大到10．0时，颗粒由长棒状向短棒状和等轴状转化，并出现针状和不规则颗粒。随着pH值的增大，纳米Tb：HA颗粒的荧光强度呈增大趋势。水热时间由3h延长到24h，纳米Tb：HA颗粒主要为短棒状和针状，颗粒长径比有减小趋势。随时间延长，颗粒中Tb实际掺入量由2．88m01％提高到2．97m01％，荧光强度也相应增强。随着Eu掺入量由lm01％增到7．5m01％，颗粒形貌由短棒状转为不规则短棒状与针状，荧光性能显著增强。 pH值由6．5增大N10．0，颗粒由棒状向等轴状转化。Eu含量呈减小趋势，其荧光强度也随之呈微弱的降低趋势。水热时间由3h延长至lJ24h，颗粒主要为短棒状和等轴状，颗粒长径比有减小趋势。Eu实际掺入量有减小的趋势，荧光强度呈减弱趋势。.（3）Arg-mHAP对脱氧核酶的体外包装效率可高达100%。经过不同抑制剂处理证实了Arg-mHAP/DZ1复合物是通过能量依赖的内吞作用进入细胞。此外，我们利用激光共聚焦显微技术，观察到Arg-mHAP可将靶向LMP1脱氧核酶有效地递送到鼻咽癌细胞内，并进入细胞核，发挥其生物学作用，下调靶基因LMP1的表达。在鼻咽癌裸鼠移植瘤模型中，Arg-mHAP将脱氧核酶有效地递递到肿瘤组织内，下调EBV-LMP1的表达和抑制肿瘤生长。本研究表明Arg-mHAP纳米载体可作为核酸类药物的有效递送载体，具有潜在的临床应用价值。