DNA甲基化和组蛋白乙酰化对胃癌PDX1表达的影响

胰十二指肠同源框1(PDX1)在胰腺、十二指肠及胃窦的发育分化过程中发挥重要作用。我们前期研究发现PDX1在胃癌中表达下调，高表达PDX1能明显抑制胃癌细胞的生物学功能。然而胃癌中PDX1基因表达下调的机制尚不清楚。已知DNA高甲基化及组蛋白低乙酰化能抑制抑癌基因或肿瘤抑制因子的转录，与肿瘤发生密切相关。因此推测，启动子DNA高甲基化和组蛋白低乙酰化可能对胃癌中PDX1的表达下调有重要影响。为验证上述假设，拟研究内容如下：1.观察DNA甲基化抑制剂（5-aza-dC）及组蛋白去乙酰化抑制剂（TSA）对胃癌细胞中PDX1表达的调节；2.构建报告基因载体，转染胃癌细胞，检测PDX1启动子活性；3.BSP和/或MSP评价胃癌中PDX1启动子DNA甲基化状态，ChIP评价PDX1启动子组蛋白乙酰化状态。本项目旨在明确胃癌PDX1基因沉默的表观遗传学机制，为胃癌的基因治疗提供新的途径。

我们前期研究发现胰十二指肠同源异型基因1(PDX1)在胃癌中表达下调，高表达PDX1能明显抑制胃癌生物学功能。然而胃癌中PDX1基因表达下调的机制未明。已知DNA甲基化及组蛋白乙酰化影响肿瘤调节基因的转录，因此推测，启动子DNA高甲基化和组蛋白低乙酰化可能抑制胃癌中PDX1的表达。本课题进行如下实验：1、免疫组化法检测胃癌组织芯片中PDX1、Dnmt1、HDAC的表达。PDX1在胃腺体细胞中正常表达，Dnmt1和HDAC则表达微弱或不表达；胃癌组织中，PDX1表达下调或缺失，Dnmt1和HDAC则表达上调，Dnmt1和HDAC蛋白的表达与PDX1呈负相关；2、分别用5’-aza-dC和TSA处理，RT-PCR检测PDX1基因表达，，5’-aza-dC和TSA 使PDX1mRNA重获表达，且有剂量和时间依赖；3、构建PDX1基因5’-侧翼区9个CpG岛报告基因，检测启动子活性，F383 (-2063~-1681nt) 有较强的启动子活性，SssI甲基化酶抑制其活性，5’-aza-dC和TSA则增强其活性；4、MSP及BSP检测胃癌细胞和组织中启动子DNA甲基化，同时评估5’-aza-dC处理前后PDX1启动子DNA甲基化状态的变化。MSP显示6株胃癌细胞F383呈完全甲基化，胃癌组织中87.5%为F383部分甲基化，12.5%为完全甲基化，癌旁组织中37.5%部分甲基化，62.5%非甲基化（p<0.05）。BSP显示6株胃癌细胞F383的CpG位点富含甲基化（77.5%~97.1%）。5’-aza-dC处理胃癌细胞后F383完全甲基化逆转为部分甲基化。；5、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）检测启动子组蛋白乙酰化。F383存在最低的组蛋白乙酰化水平，TSA处理后F383组蛋白乙酰化水平升高。课题组得出结论，PDX1启动子存在DNA高甲基化和组蛋白低乙酰化，抑制了其在胃癌中的表达。整个科研计划执行过程中，课题组不仅按期完成原研究计划内容，且额外购买胃癌组织芯片，检测PDX1、Dnmt1、HDAC三个基因蛋白的表达，胃癌组织中PDX1表达与DNA甲基化酶Dnmt1和组蛋白去乙酰化酶HDAC表达的相关性，为揭示胃癌PDX1表达沉默的表观遗传学机制提供了更多的证据。项目执行期间获得国家教育部自然科学奖二等奖和广东省科技进步二等奖各一项，发表标注资助期刊论文9篇，会议论文4篇.