肝宁方对肝细胞内质网应激调控研究

Endoplasmic reticulum plays an important role in liver-specific functions. Endoplasmic reticulum stress (ERS) is closely associated with liver damage. Regulation of ERS is expected to become a new option for the treatment of chronic liver disease. The present study attempted to investigate the effects of the Ganning formula on the endoplasmic reticulum and ERS by determining a number of markers (such as glucose-6-phosphatase, P450 enzymes, triglycerides, GRP78mRNA, IRE1a and eIF2a phosphorylation, and ATF6 expression), using different techniques including laboratory tests, proteomics, two-dimensional electrophoresis, mass spectrometry, and liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

内质网在肝脏特有功能中发挥重要的作用，内质网应激（ERS）和肝损伤密切相关,ERS调控有望成为慢性肝病治疗新的选择。肝宁方是治疗慢性乙型肝炎的广西特色有效方药。该课题通过检测酶葡萄糖-6-磷酸酶、P450酶等酶活性，Ca2+浓度，甘油三酯和胆固醇的含量，探讨肝宁方对内质网代谢、解毒、Ca2+调节功能的影响；检测ERS标志分子GRP78mRNA和蛋白表达，生存信号途径IRE1a、eIF2a磷酸化，ATF6核蛋白的表达，揭示肝宁方对ERS效应的影响；基于亚细胞蛋白质组，综合运用比较蛋白质组和N-糖基化蛋白质组学技术，将不同空间上蛋白质组群进行整合研究，蛋白、蛋白翻译后修饰生物信息学集成、关联、聚类分析，从细胞代谢、蛋白质质量控制、信号转导网络等不同方面阐明肝宁方对ERS调控模式和整合机制，为基于ERS途径的肝细胞中医药保护策略提供借鉴。

内质网应激（ERS）和肝损伤密切相关,本课题主要研究衣霉素诱导肝细胞发生ERS后产生的一系列级联反应，从不同方面阐明肝宁方对内质网应激（ERS）调控模式和整合机制。研究发现，在内质网功能方面，肝宁方可以通过调控葡萄糖-6-磷酸酶、细胞色素P450酶、N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V、α-1,2-甘露糖苷酶等，减轻肝细胞内质网应激损伤，减少甘油三酯、胆固醇的脂肪沉积，维持Ca2+稳态；在ERS效应检测中发现内质网应激标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、生存信号分子（跨膜蛋白肌醇酶1A(IRE1A)、蛋白激酶样内质网激（PERK）和活性转录因子6（ATF6））蛋白表达明显上升，肝宁方对GRP78、IRE1A、PERK、ATF6的表达均有下调作用，阻止未折叠蛋白的错误激活，减轻内质网应激损伤；在内质网比较蛋白质组学研究中，运用蛋白质组学定性定量算法（即Maxquant中的Label free 算法）对各组蛋白质组学数据进行非标记定量分析，用Perseus软件进行统计及生物信息学分析，共鉴定出肽段数15568个，蛋白质组数2430个，将模型组/对照组进行蛋白表达差异分析后，筛选出132个显著差异蛋白（P<0.05）；在内质网N-糖基化蛋白质组学研究中，N-糖基化蛋白质鉴定结果共2398个，对模型组和对照组蛋白质差异表达筛选（以倍数变化大于2倍或者下调小于0.5，且P<0.05为标准），得出55个差异蛋白，对差异蛋白质进行Gene Ontology (GO)功能注释，发现这些蛋白参与了cellular process, single-organism process,biological regulation等重要生物学过程，集中分布于各种细胞中，具有多种分子生物活性，对差异表达蛋白进行KEGG通路注释，经聚类和生物网络分析，得出内质网应激差异蛋白主要位于Protein processing in endoplasmic reticulum,Necroptosis, Alcoholism等重要通路上。肝宁方通过这些差异蛋白及信号通路参与ERS调控，修复内质网中未折叠蛋白或折叠错误的蛋白功能，有望成为慢性肝病治疗新的选择。