疏筋解毒方对帕金森病大鼠黑质内质网应激通路调控机制研究

本课题以6－羟多巴胺帕金森病模型大鼠为研究靶向，以中药复方为干预手段，从黑质内质网应激及小胶质细胞免疫应答入手，采用免疫组化、免疫印迹杂交（Western blot）、逆转录聚合酶反应（RT-PCR）等方法，对内质网中Ire1、PERK、ATF6三条信号通路在内质网应激状态时的标志物分子伴侣蛋白GRP78以及磷酸化eIF2α、XBP-1mRNA表达水平、ATF6在细胞内的位置变化等指标进行研究；对促凋亡因子caspase-12、CHOP/GADD153、炎性因子中肿瘤坏死因子、白细胞介素－6（IL-6）以及热休克蛋白（HSP70）表达变化进行分析，探讨内质网应激与黑质神经元之间的关联性；并通过离体实验观察小胶质细胞炎性应激时的活性状态和一氧化氮（NO）代谢变化，拟从角度探究中药疏筋解毒方脑保护作用的可能途径。。

帕金森病属于多因素所导致的慢性退行性中枢神经系统疾病。本研究是在前期研究的基础上，进一步探讨中药复方疏筋解毒方对帕金森病的治疗作用与黑质神经元内质网应激和胶质细胞炎性反应之间的关联性。本课题从两个方面开展相关研究：（1）在体实验研究。选择以6－羟多巴胺帕金森病模型大鼠为研究靶向并分组，从黑质内质网应激及小胶质细胞免疫应答入手，采用免疫组化、免疫印迹杂交（Western blot）、逆转录聚合酶反应（RT-PCR）等方法，对内质网中信号通路在内质网应激状态时的标志物分子伴侣蛋白GRP78、XBP-1mRNA、热休克蛋白（HSP70）表达水平等指标的影响，探索中医药复方如何对内质网应激产生调控；通过对促凋亡因子caspase-12、CHOP/GADD153的表达和小胶质细胞所介导的应激与炎症反应对肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素－6（IL-6）、影响等进行分析，探讨内质网应激与黑质多巴胺能神经元功能之间的关系。（2）离体实验研究。通过培养原代小胶质细胞，从测定小胶质细胞的细胞活力、增殖活性及其释放NO的浓度等微观方面与观察其细胞形态变化的直观角度出发，研究疏筋解毒方对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小胶质细胞激活所介导免疫炎症损伤的干预作用，探讨小胶质细胞的激活与多巴胺能神经元变性、损伤存在的可能机制。初步研究结果显示疏筋解毒方的作用大致包括：（1）调节黑质DA能神经内质网膜伴侣蛋白GRP78，能防止早期表达水平过高而导致应激损伤，以维持内质网内环境稳态调节；（2）可抑制Caspase-12 mRNA、CHOPmRNA表达，阻抑内质网神经元细胞凋亡，促进未折叠蛋白反应信号传导通路的分子伴侣XBP-1mRNA的表达，诱导PD大鼠黑质HSP7O表达上调；（3）阻抑帕金森病大鼠中脑黑质小胶质细胞所介导的炎症反应，降低神经毒性因子TNF-α、IL-6的含量；（4）能够减弱激活小胶质细胞的细胞活力及增殖活性，并降低其对NO的释放，从而减少氧化应激对神经元的损伤，发挥神经保护作用。