米糠谷氨酸脱羧酶与钙调素结合方式的研究

Glutamate decarboxylase(GAD) from plant was proved to be catalysed by Ca2+/calmodulin(CaM) due to a typical CaM binding position at the C-terminal. While the interaction of most of the plant GAD and CaM was not clear. The rice bran GAD (RbGAD) and CaM (RbCaM) were purified in the early work. In this research, the amino acid sequence at the C-terminal of RbGAD will be tested by carboxypeptidase hydrolysis method. The key domain and amino acid group in RbGAD for RbCaM connection can be identified by activity test and SPR test. Then the modle of the interaction under different environmental conditions can be stimulated by SPR test. In the mean time, NMR and X-ray will be taken to analys the structure of the compound. All the results will be considered to get the combinding pattern between RbGAD and RbCaM. And the activating mechanism of RbGAD will be clarified. The knowledge of regulate mechanism of rice bran GAD is helpful for γ-aminobutyric acid (GABA) accumulation.

谷氨酸脱羧酶（GAD）能催化L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA），植物GAD由于其C末端有一段典型的钙调素（CaM）结合部位而受Ca2+/ CaM的调节，然而大多数植物GAD与CaM的具体作用方式尚未明确。项目在得到纯化米糠GAD（RbGAD）和钙调素（RbCaM）的基础上，拟进一步研究两者的结合方式。首先通过羧肽酶水解法测定RbGAD的C末端氨基酸序列，结合活性检测和SPR生物芯片技术确定RbGAD中与RbCaM结合的关键区域和位点；利用SPR技术实时检测不同环境条件（金属离子种类、离子强度、辅基、拮抗剂）下RbGAD和RbCaM的动态结合规律；采用蛋白质晶体学和核磁共振技术（NMR）对RbGAD（或RbGAD肽段）和RbCaM的复合物结构进行解析；结合生物信息学预测结果，探讨RbGAD和RbCaM的结合方式，从分子层面阐明RbGAD的活性调节机制。研究对利用米糠内源GAD富集GABA具有重要的理论意义与实际价值。

米糠是稻谷在加工过程中重要的副产物，其开发和利用具有重要的意义。米糠具有较高的GAD活性可以促进GABA的合成，项目以米糠作为原料，提取其谷氨酸脱羧酶（GAD）和钙调素（CaM），并研究了米糠GAD的酶学性质和光谱学性质，还利用光谱学、表面等离子共振技术（SPR）结合氨基酸修饰推测两者结合的关键氨基酸残基，探究了GAD和CaM之间的结合方式，为进一步研究GAD与CaM的相互作用、调节GABA的合成反应、提高米糠的附加值提供理论依据。本文的主要研究内容如下：.通过Native-PAGE电泳法得到了三个米糠GAD同工酶，分别标记为GAD1、GAD2和GAD3，相对分子质量分别为34551.322、29745.880和35016.661。利用Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析方法分离纯化得到米糠CaM，分子质量大概为16966.015。.米糠GAD1的最适反应温度在40℃；而GAD2和GAD3最适反应温度在45℃。GAD1、GAD2和GAD3耐热性均较差。米糠GAD1和GAD3的最适pH都在5.5左右，在此pH之外，酶活均不高，在pH值3以下和8.5以上相对酶活降到50%以下。GAD2的最适pH在6左右，并在pH为4.0-8.0范围内能保持一定的酶活力，相对酶活都不低于60%，但在pH大于8.0时大幅下降，相对酶活低于60%。.利用CD光谱、紫外-可见、荧光、FT-IR等方法测定米糠三种同工酶的光谱学性质，得到米糠三种GAD同工酶的二级结构的大致范围：α-螺旋为37.10-37.25%，β-折叠为0-21.45%，β-转角为5.35-28.12%，无规则卷曲为34.78-35.95%。.GAD1、GAD2和GAD3都是CaM依赖蛋白，在CaM的浓度为0.4mg/mL-0.6mg/mL之间时，对GAD的激活作用随着浓度的增加而增加。氨基酸化学修饰结果显示：Lys残基是米糠GAD的三种同工酶活性中心的重要氨基酸，Arg和Tyr残基与米糠GAD的活性有关，Trp和His不是米糠GAD三种同工酶活性的必需基团，且酶活性中心应该包括α-螺旋结构，α-螺旋结构的微小变化就引起GAD活性的较大变化。.CaM与米糠GAD结合后使GAD的β-折叠结构发生了巨大变化，推测CaM能作用于GAD的β-折叠结构，进而影响其结构和功能。