miR1调控apoE基因敲除鼠内皮细胞MLCK的表达及分子机制

动脉粥样硬化(AS)严重威胁人们的身心健康，其发病机制至今尚未完全明了。异常基因蛋白分子的表达和信号转导通路改变是AS形成的重要机制和研究热点。在AS形成过程中动脉内皮细胞肌球蛋白轻链激酶(MLCK) 高表达起着至关重要的作用，抑制其表达可以达到抗AS目的。PTK-Ras-Raf-MAPK通路的激活可以引发一系列的下游基因蛋白(包括MLCK)表达变化，形成瀑布效应，导致AS的发生。近期研究发现microRNA1(miR1)在AS过程中异常表达，miRNA靶基因预测提示PTK-Ras-Raf-MAPK通路蛋白是其潜在靶标。本项目在整体动物模型和体外细胞两个层面上考察miRNA1对PTK-Ras-Raf-MAPK信号转导通路的异常改变以及对MLCK mRNA和蛋白表达以及活性的影响，力图从PTK-Ras-Raf-MAPK通路上寻找新的抗AS作用药物靶点，为AS的预防提供实验依据。

我们复制了apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型，分析结果表明实验性As apoE基因敲除小鼠动脉内膜通透性明显增加，程度与动脉粥样硬化的发展呈明显正相关；随动脉壁MLCK 表达的逐渐增强、活性逐渐升高，动脉内膜的通透性也逐渐增加，MLCK表达和活性的变化增加与动脉内膜通透性呈明显正相关， MLCK mimic明显降低通透性，抑制动脉壁MLCK的表达和降低MLCK的活性；MLCK antagomir明显升高通透性的作用，促进动脉壁MLCK的表达和增加MLCK的活性； .培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养液加入oxLDL，当oxLDL浓度达到150µg/ml时，MLCK表达达到最高值，随oxLDL浓度进一步加大，MLCK的表达出现下降趋势。检测MLCK的表达发现细胞培养24小时，MLCK的表达最大。随oxLDL浓度的逐步增加，miR1的表达越来越低。随培养时间的逐步延长，miR1表达越来越低。miR1 mimic明显降低ox-LDL引起的血管内皮细胞MLCK表达和MLC磷酸化，miR1 mimic同时能明显降低ox-LDL引起的血管内皮细胞ERK和P38磷酸化；miR1 antagomir明显增加ox-LDL引起的血管内皮细胞MLCK表达和MLC磷酸化，miR1 antagomie同时能明显升高ox-LDL引起的血管内皮细胞ERK和P38磷酸化。利用荧光素酶报告基因检测技术对miR1的靶标进行检测，发现在WT-LCU-MLCK质粒中，miR1 mimic能显著降低luciferase activity，而在MU-luc-MLCK质粒中，miR1 mimic并不能降低luciferase activity，表明miR1的直接靶标可能为MLCK..结果表明高胆固醇血症血液中的某些成分，如oxLDL激活MAPK，信号通过一系列转导进入核内，使转录因子磷酸化，促进增殖和分裂有关基因（包括MLCK）的表达，同时也激活MLCK；MLCK表达和活性增加可促进MLC的磷酸化，MLC磷酸化可引起内皮细胞向心性收缩，内皮细胞向心性收缩，引起内皮细胞间隙增大，导致内膜通透性增加，血液中oxLDL等通过增大的内皮细胞间隙进入动脉壁，促进AS的发生与发展。miR1高表达导致MAPK受抑制, 进而使得MLCK表达减弱，磷酸化MLC降低，内皮细胞向心行收缩和通透性降低，从而阻止AS的发生。