清脑通络片及其有效成分对ApoE基因敲除鼠脑血管微栓子的栓子外渗作用研究

"脑血管栓子清除新机制被揭示"被美国卒中学会评选了2010年卒中领域十大研究进展，说明脑血管微栓子研究是目前该领域的研究前沿。它揭示了脑血管保持畅通的新机制，未能溶解的微栓子经血管壁被排出到周围组织，保持脑血流通畅，但很多因素能造成脑血管对栓子的清除能力下降，其中脑动脉硬化是最主要的原因之一，活血化瘀方药可能促进脑血管对栓子的清除能力。我们通过临床总结出，中风先兆期核心病机是"肝热血瘀"，创立了"清脑通络汤"。本研究采用ApoE-/-小鼠高脂饲料饲养形成动脉粥样硬化模型，在此基础上，复制脑血管微栓子模型，采用荧光定量分析清脑通络片及其有效成分决明子提取物、川芎提取物和水蛭提取物对用栓子外渗作用的影响。并对脑血管对微栓子的外渗作用进行超微结构分析。通过荧光免疫组化法对低氧探针、ZO-1、CD31 、MMP-2、MMP-9进行荧光定量分析, 阐明其作用途径。

缺血性卒中是严重威胁人类健康的一类疾病，具有高的发病率、致残率及病死率等，寻找有效的缺血性卒中二级预防药物具有十分重要的意义。而微栓子在TIA和缺血性卒中患者的发病及早期复发中有关键作用，2010年脑血管微栓子外渗作用的发现被AHA/ASA评为当年卒中领域的十大研究进展之一，针对微栓子外渗机制的研究可能为卒中二级预防药物的拓展提供支持。清脑通络方是张学文教授多年临床经验总结出来的对小中风有良效的复方，其理论依据是“肝热血瘀”为中风病的关键环节，治当“清肝和血，化瘀通络”。本研究即探讨清脑通络方及其有效成分川芎嗪对ApoE基因敲除（ApoE-/-）鼠脑血管微栓子外渗的影响，为清脑通络方用于中风的防治提供依据。.本研究采用小鼠颈内动脉荧光微栓子注入模型模拟人脑血管微栓子，首先探索栓子外渗随时间变化情况以及清脑通络方和有效成分川芎嗪对ApoE基因敲除鼠不同时间点的栓子外渗的影响。研究发现栓子注入后2h脑组织内可观察到少量栓子外渗，随着时间的延伸（24h、72h），栓子外渗量逐渐增加，在24h至72h栓子外渗率增加明显。在各个时间点ApoE-/-组栓子外渗率同C57BL/6对照组相比明显减少，而清脑通络方能显著改善栓子外渗，川芎嗪组在24h和72h的栓子外渗率较ApoE-/-组增加。且清脑通络方能改善血管的内中膜结构异常，减轻脑组织的损伤。鉴于栓子外渗在24h至72h增加明显，故后续研究选取栓子注入术后48h时间点探讨清脑通络方对ApoE-/-鼠复制的动脉粥样硬化模型栓子外渗的改善机制。结果表明与C57BL/6对照组相比，模型组甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、MDA和LPO的含量明显升高，高密度脂蛋白胆固醇水平、SOD活力及栓子外渗率显著下降；与模型组相比，清脑通络方能改善血脂水平，降低MDA和LPO含量，提高SOD活力和栓子外渗率。模型组CD31和ZO-1的水平较对照组明显降低，MMP-2和MMP-9的水平明显升高，而清脑通络方及川芎嗪能够上调CD31和ZO-1的表达，降低MMP-2和MMP-9的水平。同时明胶酶谱结果提示AS时MMP-9活性增高明显，而清脑通络方可以降低MMP-9的活性，减轻细胞外基质的降解。结果提示清脑通络方及川芎嗪能够通过抗氧化应激、保护紧密连接等改善栓子外渗。本研究为清脑通络方用于中风的防治提供了依据。