五种常见真菌毒素模拟表位的分子改造及其在免疫检测中的应用研究

真菌毒素是食物链中最重要的污染物之一，也是目前影响我国食品安全的主要因素，真菌毒素的检测方法较多，其中又以竞争性免疫检测应用较广，但是该类方法必须以有毒标准品为原料进行人工抗原的化学合成，具有污染大、成本高且批次误差大等缺点。有鉴于此，目前国内外试图开展无毒免疫检测技术以弥补其缺陷，主要集中于模拟表位及抗独特型抗体的应用，但是也面临制备周期长、制备困难或是不耐受免疫检测外环境、不具备定向改造等问题。本研究拟在获得五种常见真菌毒素噬菌体展示模拟表位的基础上，采用外源基因表达及分子改造的理论和方法，从结构化学的角度，构建不以噬菌体为展示介质的新型模拟表位，同时通过分子动力学模拟及生物分子相互作用分析，探析新型模拟表位的构象、组成及其免疫检测性能的关系，探讨将真菌毒素新型模拟表位应用于免疫检测的可行性，为从理论和方法上研究小分子物质人工抗原的生物合成开拓新的思路。

真菌毒素是影响我国食品安全的主要因素之一。目前，检测真菌毒素的方法以竞争性免疫检测应用较广，但该法须以毒素标准品合成人工抗原，污染大、成本高且批次误差大。现阶段研究的无毒免疫检测技术主要为模拟表位及抗独特型抗体的应用，但也有制备难、周期长、不稳定和不易定向改造等弊端。.本研究构建了五种真菌毒素的新型模拟表位，系统分析了他们的构象、组成及其免疫检测性能的关系，探讨了其用于免疫检测的可行性，结果提示新型模拟表位有望取代小分子抗原用于真菌毒素的免疫分析系统。为小分子物质人工抗原的生物合成开拓了新思路，为建立绿色免疫分析方法奠定了理论基础，具有重要的理论意义和应用价值。主要研究结果如下：.赭曲霉毒素A(OTA) 基于OTA-MBP的化学发光ELISA的LOD为0.22 ng/mL，IC50 0.82 ng/mL，工作范围0.31-2.17 ng/mL；OTA-MBP的膜基质免疫分析法的阈值为5 ng/mL。.伏马菌素B1(FB1) 基于 FB1-MBP 的icELISA （ IC50 为2.15±0.13 ng/mL）比基于FB1-BSA的icELISA （IC50 为 21.39±1.15）的灵敏度提高了约 10 倍。基于FB1-MBP 膜基质检测 FB1免疫分析法（检测阈值为 2.5 ng/mL）比 基于FB1-BSA 的灵敏度提高了10倍。. 黄曲霉毒素B1(AFB1) 抗AFB1独特型纳米抗体，既能与AFB1竞争结合抗AFB1单抗，又能诱发Babl/c小鼠产生抗AFB1多抗。构建了AFB1非标记免疫阻抗传感器，检测时间50 min， LOD为10 fg/mL，检测范围10 fg/mL-10 pg/mL；与AFB2、AFG1、AFG2的交叉反应率分别为2%、27%和21%，与DON、OTA无交叉反应；玉米样品中的加标回收率为80.0±5.0%-112.0±2.5%。.玉米赤霉烯酮(ZEN) 建立了基于Z5-MBP的检测谷物中的ZEN icELISA；建立了基于ZEN抗独特型抗体噬菌体的荧光定量PCR，LOD 6.5 pg/mL ,线性范围0.01-100 ng/mL。其检测实际样品的结果与LC-MS/MS 的线性相关性为R2=0.993。. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON) 基于纳米抗体N-28的检测谷物中DON-icELISA的灵敏度比基于DON