激活mTOR和JAK/STAT信号通路联合任务向导性康复训练促进脊髓损伤大鼠轴突再生的作用和机制研究

The failure of axon regeneration after spinal cord injury (SCI) is one of the main reasons that causes long lasting devastating consequences to the patients. However, to enhance the intrinsic axon regeneration ability maybe a breakthrough point to cure SCI. Our previous study has identified the correlation of mTOR signal pathway with the intrinsic axon regeneration capacity. Together with latest researches, we propose the hypothesis that the activation of both AKT/mTOR and JAK2/STAT3 could increase the intrinsic axon regeneration of injured spinal cord robustly. Here, cervical spinal cord crush injury model will be used. And antisense oligonucleotides (ASOs) will be employed to inhibit PTEN and SOCS3 in a non-transgenic way, which lead to activation of mTOR and STAT3 pathway. Base on this, the task-based rehabilitating training will be practiced, then the relationship of axon regeneration, rehabilitating training and functional recovery will be analyzed using chemical genetics techniques (DREADDs). The mechanisms of intrinsic axon regeneration to promote the functional recovery of spinal cord injury will be illustrated from this injury-regeneration-functional recovery three-dimensional point of view. In summarize, we here try to demonstrate a new therapeutic strategy for SCI which might contribute to possible clinical application.

轴突再生困难是脊髓损伤患者无法完全康复的主要原因之一，而如何提高减弱的成体神经元内源性再生能力则是解决这一难题的关键。前期研究发现mTOR通路与内源性轴突再生调控密切相关，结合最新证据，我们提出同时激活AKT/mTOR和JAK2/STAT3信号通路更能极大的提升脊髓损伤后神经元的内源性轴突再生能力。本项目拟使用脊髓损伤大鼠模型，利用非转基因方法-反义寡核苷酸多肽（ASOs）联合抑制pten和socs3从而激活mTOR及JAK/STAT3，在实现轴突再生能力增强的基础上联合任务向导康复训练，促进再生诱导的功能恢复，并利用化学遗传方法揭示神经再生-康复训练-功能恢复三者之间的内在关系。本项目将从神经损伤-再生修复-功能恢复的三维角度阐释调控内源性再生能力促进脊髓损伤功能恢复的机制，为再生研究的临床转化提供思路和借鉴。

本研究以激活Akt/mTOR和JAK2/STAT3信号通路提高成体神经元内源性再生能力为出发点，在实现轴突再生能力增强的基础上联合任务导向性康复训练，从神经损伤-再生修复-功能恢复的三维角度探讨调控内源性再生能力促进脊髓损伤功能恢复的机制。课题组首先成功构建皮质神经元特异性PTEN抑制或特异性SOCS3抑制的小鼠模型，并用激光共聚焦显微镜观察到皮质第Ⅴ层锥体神经元内成功激活Akt/mTOR和JAK2/STAT3信号通路。其次，通过脊髓PKCγ染色确定我们构建了稳定的左侧颈5半切损伤模型（损伤皮质脊髓束）。进一步利用BDA顺行示踪剂观察单独抑制PTEN、SOCS3或联合抑制PTEN/SOCS3小鼠的轴突再生情况，发现联合抑制PTEN/SOCS3小鼠皮质脊髓束轴突再生能力明显强于其他组。我们继续探讨任务导向性康复训练的加入能否对再生能力提高的小鼠有进一步促进轴突再生及功能恢复的作用。首先设计了一款特异性训练小鼠上肢抓取功能的训练盒，通过反复实验得出一套适合小鼠的训练参数。继续利用BDA顺行示踪皮质脊髓束观察轴突再生情况，免疫荧光观察突触重塑及再生轴突与神经元的相互联系，并用水平楼梯及圆筒探索实验检测所有小鼠的运动功能。本课题组研究发现当激活mTOR通路与任务导向性康复训练联合时，不仅能进一步提高轴突再生的长度，还能促进病灶上方的轴突以出芽的形式与灰质前角内的神经元相互联系。同时任务导向性康复训练的介入能促进再生轴突重塑突触结构融入有功能的神经回路。这些神经结构性的改变最终表现为联合治疗组小鼠其行为学功能的改善优于其他组。随后，我们采用DREADDs化学遗传技术在大鼠运动皮质注射Cre 依赖的AAV-hSyn-dio-hM4Di-mCherry，同时在脊髓病灶远端注射AAV-Cre。下一步通过干扰再生能力激活的皮质神经元电活动，探讨康复训练与轴突再生在功能恢复中的机制。结论：在同时激活mTOR和JAK/STAT信号通路极大提高内源性神经再生能力的基础上，进一步采用任务导向性康复训练的方式完成对再生轴突的引导和突触重塑，达到最佳的功能恢复，其机制与康复训练提高皮质神经元电活动有关。意义：本课题不仅能增加我们对调控内源性再生能力促进SCI 恢复的理解，还揭示了任务导向康复训练—再生轴突的突触形成—功能恢复三者之间相互作用机制，为再生研究的临床转化提供思路。