Slit2-Robo4对脓毒症心肌的保护作用及机制研究

心肌损伤是脓毒症患者病死率高的重要因素。心肌微循环内皮屏障功能、细胞因子风暴是脓毒症心肌损伤的重要环节，整合素结构和功能影响内皮屏障功能。最新研究报道：神经迁移蛋白Slit2通过其受体Robo4能增强内皮屏障功能，减少细胞因子风暴对肺组织的损害；Slit蛋白对神经系统和胚胎血管内皮中的整合素有影响。但Slit2-Robo4途径对脓毒症心肌损害是否有保护作用尚不清楚。本课题组既往研究结果提示，整合素可能参与脓毒症心肌损伤时心肌微血管内皮屏障功能损害。本项目拟在体外细胞模型和体内动物模型中，采用基因敲除、RNA干扰、抗体阻断、细胞生物学等方法，探讨Slit2-Robo4途径是否对心肌微血管内皮屏障功能具有调节作用、对脓毒症心肌损伤有保护作用，明确整合素是否参与Slit2-Robo4途径对心肌微血管内皮屏障功能的调节。本研究将为阐明脓毒症心肌损伤的分子机制及其防治靶点的确定提供创新理论依据。

脓毒症时容易出现心脏损伤，其机理尚不清楚。我们的既往研究发现，脓毒症大鼠心肌组织水肿，炎症细胞浸润，心肌纤维断裂，提示心脏微血管通透性增高可能与脓毒症心肌损伤有关。本研究分为体外实验和体内实验，结果如下:一、体内实验：（1）脓毒症时大鼠心脏微血管通透性增高，心功能下降，局部心肌组织中其表达也明显增高，Slit2表达下降，Robo4表达增加。（2）尾静脉注射补充循环中Slit2-N片段，脓毒症大鼠心脏微血管通透性明显下降，心脏功能改善，局部心肌组织中炎症因子表达明显降低。（3）Robo4基因敲除的脓毒症大鼠与普通脓毒症大鼠相比，局部心肌组织中炎症因子表达明显增高，心肌病理损伤加重，心功能下降程度加重。（4）Slit2-N片段注射ROBO4敲除组大鼠心肌组织炎症降低，心功能有改善。体内实验证明Slit2- ROBO4可以降低脓毒症大鼠心脏微血管通透性，改善心脏功能，降低心肌组织中的炎症。二、体外实验：（1）LPS刺激后大鼠心脏微血管内皮细胞（RCMECs）通透性增加，采用Slit2-N片段预处理单层RCMECs，通透性明显下降；采用质粒转染技术下调RCMECs中Robo4表达，通透性明显升高。（2）Slit2-Robo4调节RCMECs通透性作用机制可能是通过抑制Src/VE-Cadherin信号通路产生的。（3）LPS刺激后细胞骨架F-actin重构，但补充Slit2-N及下调Robo4表达均无明显影响。体外实验表明Slit2-Robo4可以通过Src/VE-Cadherin信号通路来抑制RCMECs通透性，但对细胞骨架重构无明显影响。在本实验基础上，我们还发现其他结果：（1）LPS可诱导心肌细胞自噬，同时上调β3整合素的表达。双向干预β3整合素可通过PI3K/akt信号通路减少或加强LPS诱导的心肌细胞自噬。（2）双向调节β3整合素表达能显著降低或增高LPS诱导的RCMECs通透性，且作用机制可能是通过抑制细胞骨架重构，但并不通过影响Src/Rac1信号途径活化。本课题研究进一步揭示了Slit2-Robo4信号途径在脓毒症心肌损伤中的保护作用及相关可能机制，为脓毒症心肌损伤的防治及新的治疗靶点的确立提供理论依据和创新思路。