淫羊藿总黄酮及其主要活性成分抗帕金森病的分子作用机制研究

传统中药淫羊藿具有悠久的临床应用历史，研究表明淫羊藿具有多方面的药理作用。本课题组在预实验中已从淫羊藿总黄酮成功筛选出了具有类雌激素样作用的主要活性成分。本研究拟应用综合性多学科技术手段和现代生物学技术，从分子、细胞和整体三个评价层面首次系统研究淫羊藿总黄酮及其主要活性成分对多巴胺能神经元的保护作用及其分子机制，阐明其类雌激素样作用、抗凋亡作用及其可能的信号途径和作用靶点。本工作不仅为传统中药神经保护作用的分子作用机制提供直接的实验依据，而且为研发PD的预防与治疗药物提供新的思路。

本研究采用MTT、流式细胞术、实时定量PCR、免疫组化、免疫印记及荧光素酶活性检测等多种评价方法，系统探讨了淫羊藿总黄酮及其主要活性成分淫羊藿苷对帕金森病(PD)细胞模型和动物模型中多巴胺能神经元的保护作用及其机制。在PD细胞模型，本研究应用1-甲基-4-苯吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)诱导多巴胺能神经元细胞系MES23.5细胞损伤，探讨淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷对MES23.5细胞的保护作用及其可能机制。结果显示，淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷可剂量依赖式对抗MPP+的毒性作用；MPP+可明显降低酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞数，淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷预保护可逆转上述改变；淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷预保护可对抗MPP+对线粒体膜电位的降低；淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷预保护可对抗MPP+对Bcl-2基因蛋白表达的降低作用和对Bax基因蛋白表达的升高作用。质粒转染结果显示，淫羊藿苷对雌激素反应元件(ERE)启动子的荧光活性没有明显影响。表明在离体细胞水平淫羊藿苷的神经保护作用不是通过雌激素信号途径。进一步的机制研究显示，淫羊藿苷可时间依赖式地增强MES23.5细胞Akt及ERK的磷酸化水平。此作用可以被PI3K阻断剂LY294002及MEK阻断剂PD98059所阻断。以上结果表明淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷的神经保护作用可能与PI3K/Akt途径与MEK/ERK途径的激活有关。应用实时定量PCR芯片进一步揭示了淫羊藿苷抗凋亡的机制。在PD动物模型中，本研究应用MPTP制备的OVX PD 模型小鼠，口服灌胃给予不同剂量的淫羊藿总黄酮或淫羊藿苷，在灌胃的同时侧脑室给予PI3K阻断剂LY294002或MEK阻断剂PD98059，采用高效液相色谱法检测小鼠纹状体多巴胺的含量。免疫组织化学染色检测黑质致密带酪氨酸羟化酶免疫反应阳性神经元的表达；免疫印记检测Bcl-2、Bax、pAkt、Akt、pERK及ERK的蛋白表达。结果表明淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷能够对抗神经毒素对PD模型小鼠黑质纹状体系统多巴胺能神经元的损伤；淫羊藿苷的神经保护作用可以被PI3K阻断剂LY294002或MEK阻断剂PD98059所阻断。本工作不仅为传统中药神经保护作用的分子作用机制提供直接的实验依据，而且为研发PD的预防与治疗药物提供新的思路。