丹参酮生物合成途径多基因瞬时表达体系建立及其前体物质合成研究

In metabolic engineering of antemisinin and taxol in microbial system, the precursors of them have been achieved. Artemisinin can be full biosynthesized in heterologous plant system, which expressed five plant- and yeast-derived genes in a single vector. Multigene transformation (MGT) is being gradually accepted as an approach to generate plant with complex secondary metabolic pathways. In this project, we choose six genes of tanshinones biosynthesis pathway: SmHMGR1，SmGGPPS，SmKS1，SmCPS1，SmCPR1 and SmCYP76AH1 to assemble multigene binary vectors by using linked transformation and unlinked transformation approach, in which all of genes was placed under the control of different promoter and terminator sequences. Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 carrying these vectors was used for stable transformation of Nicotiana tabacum by the standard leaf-disc transformation method. SmKS1，SmCPS1 and SmCYP76AH1 were cloned in frame upstream of EGFP in pE3025 vector. The resulting plasmids were used for transformation of protoplasts isolated from Arabidopsis thaliana leaf and cellular localization of EGFP signal was analyzed by fluorescence microscope. Expression of all six genes in transgenic plants was confirmed by realtime PCR analysis. Tanshinones production was monitored in independent transgenic tobacco lines using UPLC-MS. To further validate tanshinones presurors identification, extracts were analyzed using UPLC. A. tumefaciens harbouring binary vectors of 6 genes of tanshinones pathways are infiltrated into leaves of N. benthamiana for transient expression. The experiments in this project are designed to address the Tanshinones biosynthesis pathway and provided a plant-based platform for studying on secondary metabolism pathway in traditional Chinese medicine.

利用大肠杆菌或酵母系统通常产生青蒿素或紫杉醇前体物质，日渐成熟的植物代谢工程将青蒿素合成途径多个基因整合到烟草基因组中，产生青蒿素。多基因转化成为研究或操控完整代谢途径新体系。本研究拟将前期研究成果-丹参酮生物合成途径6个基因：SmHMGR1、SmGGPPS、SmKS1、SmCPS1、SmCPR1、SmCYP76AH1分别与6个不同启动子和终止子连接，构建不同基因组合的植物表达载体；叶盘法转化烟草；筛选获得遗传稳定的转基因烟草植株；检测转基因植株中丹参酮相关基因的表达及定位情况；利用代谢组学检测烟草中代谢产物的变化情况，结合UPLC检测丹参酮前体物质次丹参酮二烯和铁锈醇等物质。利用农杆菌渗入法即瞬时转化方法，将构建的含丹参酮生物合成关键酶基因的不同组合载体转化本生烟草，建立植物代谢途径多基因瞬时表达体系。本项目对解析丹参酮生物合成途径，研究中药有效成分生物合成途径提供新的策略和技术平台。

利用植物代谢工程，将代谢途径中的多个基因转化到模式植物中表达是生物合成研究的又一个热点。本项研究主要做了①建立了稳定的整合萜类合酶基因的烟草转化体系。将萜类合酶基因构建到植物双元表达载体上，利用叶盘法，转化烟草叶片，经过抗生素筛选、PCR鉴定，获得稳定整合在烟草基因组中的萜类合酶基因的烟草植株。利用顶空-气相色谱质谱联用分析了CcTPS1-OE与EV-OE转基因烟草中化合物差异，发现在CcTPS1-OE转基因烟草株系中二氢猕猴桃内酯等含量降低，而烟碱/尼古丁/1-甲基-2-吡咯烷基-吡啶等含量增加。这些结果表明萜类合酶CcTPS1参与烟草次生代谢产物的生物合成过程。②建立了本生烟草的瞬时表达体系。分别构建了丹参生物合成相关酶基因启动子和转录因子的效应子和报告子植物双元表达载体，转化根癌农杆菌，注射渗透法侵染本生烟草叶片，效应子能启动报告基因表达。再利用烟草瞬时表达体系，做了丹参酮生物合成酶复合体中2个酶的相互作用，检测出这2个蛋白有相互作用，且通过western blotting检测2个蛋白在本生烟草叶片中有积累。这些结果表明此烟草瞬时系统是可以表达出蛋白质，为后续实验打下基础。③建立解析丹参酮生物合成途径中间产物的快速检测平台。分析了丹参酮生物合成过程中6个酶的细胞定位信号、跨膜区域和亚细胞定位，分别将这6个基因进行6组不同类型组合，构建到瞬时表达载体pEAQ-HT上，共22个重组载体。转化根癌农杆菌，通过不同的菌组合，渗透注射本生烟草叶片，喷施酶底物，通过GC-MS检测丹参酮生物合成过程中间代谢产物，一些酶组合中能检测到中间产物，但烟草中化合物的背景也比较高，后续还要进一步优化化合物检测。④克隆了丹参12-氧-植物二烯酸还原酶（OPR）基因，构建了这个基因干扰载体，转化丹参，得到OPR-Ri丹参干扰植株，检测了丹参酮生物合成基因在干扰株系中的表达，发现丹参酮生物合成途径中GGPPS，CPS，KSL及P450基因的表达量均下调，4种丹参酮类化合物含量都有不同程度下降，表明OPR影响了丹参酮的生物合成。将这个酶进行了原核表达，western blotting检测结合质谱，确定表达的酶是OPR酶，并成功进行了催化反应，表明得到的OPR是有生物活性。⑤克隆了樟萜类生物合成途径中2个酶基因，并对其功能进行了初步研究，为后续研究萜类化合物生物合成途径打下基础。