单细胞水平解析TGF-β1在造血干细胞中的作用及机制

Quiescence state is closely associated with hematopoietic stem cell (HSC) maintenance, resolving quiescence regulation is prerequisite for HSC expansion in vitro and transplantation. Transforming growth factor β1 (TGF-β1) is a classical signal for HSC regulation, however, increasing research indicate that TGF-β1 have diverse effects on heterogeneous HSC population. We have established single-cell function study model for mouse HSC in vitro and in vivo. Our previous data showed HSC express different TGF-β receptors, and at low concentration TGF-β1 decreased cell division, slowed down cell cycle progression of HSC, consequently suppressed hematopoietic reconstitution and multiple differentiation of HSC in vivo. However, the intrinsic regulatory mechanisms remain unclear. We will further investigate the mechanisms: 1. Investigate downstream key factors of TGF-β1 involving in the cell cycle and function regulation of HSC by single-cell PCR, RNA-sequencing and immunofluorescence analysis. 2. Identify the signal targets in TGF-β receptors knock out HSCs. The intensive study of this project will discover new molecular targets of HSC function regulation and provide important theory basis for HSC transplantation and HSC-based therapy.

静息状态与造血干细胞（HSC）功能的维持密切相关，系统解析其静息调控过程是拓展HSC体外扩增和骨髓移植的先决条件。转化生长因子β1（TGF-β1）是经典的造血干细胞信号调节分子，但越来越多研究表明TGF-β1对异质性HSC作用不尽相同。我们前期建立了小鼠HSC单细胞体内外功能研究体系并发现HSC上存在TGF-β受体表达差异，低浓度TGF-β1显著减少HSC的细胞分裂次数和阻断细胞周期进程，最终抑制体内造血重建和多向分化潜能，但是其具体的机制尚不清楚。本课题将在此基础上对分子机制展开系统研究：1、通过单细胞PCR、RNA-sequencing、免疫荧光等方法研究TGF-β1下游关键的信号分子调节HSC细胞周期和功能的机制；2、利用TGF-β受体敲除的HSC模型寻找调控网络的关键靶点。该研究结果有望为HSC的功能调控提供新的干预靶点，同时也为HSC骨髓移植和基于HSC的治疗提供重要的研究基础。

造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）是一种具有自我更新、多向分化与重建造血潜能的成体干细胞。造血系统的建立和稳定依赖于HSC自我更新和多向分化的平衡。造血干细胞休眠具有重要的生理学意义，在有造血压力情况下可以防止未成熟的HSC耗竭。TGF-beta1被报道是维持体内HSC休眠的候选因子。HSC具有高度的异质性，由一系列不同类型不同潜能的HSC组成。单细胞技术被用来研究HSC间的异质性问题。据报道，TGF-beta1在低浓度时刺激髓系分化倾向的HSC分裂增殖，抑制淋系分化倾向的HSC分裂增殖。本研究运用一系列单细胞技术和方法研究TGF-β1对HSC的休眠和细胞分化命运的作用及其机制。.单细胞RNA-seq结果显示SCF+TPO干预后HSC细胞周期相关基因表达上调，使得HSC进入细胞周期，而TGF-beta1作用之后50%细胞的细胞周期相关基因表达上调，另有50%细胞发生细胞周期的阻滞。.单细胞免疫荧光检测显示在体外培养过程中大部分HSC进行了对称性分化，小部分HSC进行了不对称分裂和对称性分裂。在TGF-beta1培养条件下，大部分HSC进行了对称性分裂，小部分HSC分别进行了对称性分化和不对称分裂。TGF-beta1减慢HSC细胞增殖的同时，使得HSC第一次分裂中对称分裂细胞比例增加，但是TGF-beta1信号通路下游的p-Smad并未在HSC中聚集。.我们构建了Cas9fl/-Cre+/-小鼠模型，在单细胞水平运用sgRNA敲除HSC上的Tgfbr1和Tgfbr2受体，再移植进入致死剂量照射的小鼠体内，结果显示HSC的谱系分化明显受阻，重建效率也显著降低。.结论：在体外培养之后，HSC进入细胞周期并表达TGF-beta受体1和2。处于细胞周期中的HSC在TGF-beta1体外干预后进入细胞周期阻滞，细胞大部分处于缓慢增殖状态。在细胞周期阻滞之后，HSC的自我更新能力降低，长周期造血重建水平降低，伴随着分化潜能偏向于淋巴细胞系的变化。我们的研究结果显示TGF-beta1在体外培养条件下负性调控造血干细胞的功能，而TGF-beta1诱导的细胞周期停滞与体内HSC处于G0期并不相同。本研究为进一步认识TGF-beta1对造血干细胞的作用以及HSC细胞周期调控的研究打下了夯实的基础，也对造血干细胞体外扩增这一研究方向提供参考.